罗勒多糖对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的作用

陈召慧 张成华 王萍 李兰 朱庆均

摘 要：目的：研究罗勒多糖对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织病理的影响。方法：将40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为假手术组，模型组，罗勒多糖高、中、低剂量组。模型组和罗勒多糖组小鼠，气管注射博来霉素（1.5mg/kg），诱导其肺纤维化，假手术组注射等量生理盐水同法造模。罗勒多糖组小鼠每天用100、50、25mg/kg罗勒多糖，假手术组、模型组小鼠同法给药相应剂量的生理盐水，每天给药。造模28d后处死小鼠，肺组织病理切片进行HE和Masson染色，观察肺泡炎和肺纤维化程度，ELISA检测肺组织羟脯氨酸含量。结果：与模型组相比，罗勒多糖不同剂量组小鼠肺组织胶原染色明显减少，肺泡间隔增厚程度较轻，区域性实质性病变少见，炎症细胞浸润减少，纤维化程度均有所减轻，羟脯氨酸含量下降，中、高剂量组优于低剂量组。结论：罗勒多糖能减轻博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织炎症和肺纤维化程度，是一种潜在的可用于特发性肺纤维化（IPF）治疗的中药提取物。

关键词：罗勒多糖;肺纤维化;小鼠;博莱霉素

特发性肺纤维化（IPF）发病率高，预后差，晚期患者中位生存期仅3～5年[1]。IPF的诱发病因不明，目前认为年龄（大于60岁）、性别（常见于男性）和某些相关致病风险因素导致的基因异常与IPF发病密不可分[2]。在过去的10年，IPF的发病率和患病率总体呈上升趋势。从全球来看，发病率总体在1/10 000左右[3]，治疗以肺移植为根治手段，但由于供体较少，有局限性[4]。目前用于治疗IPF的药物很少，全球范围内仅有吡啡尼酮和尼达尼布被批准用于特异性地治疗IPF[5-6]，但疗效并不理想。近年来，研究者们利用动物模型或细胞模型发现，黄芪多糖、红芪多糖、当归多糖、枸杞多糖、高山红景天多糖、百合多糖等多种植物多糖具有抗IPF作用[7-13]，但关于罗勒多糖抗IPF的研究尚未见他人报道。利用博莱霉素诱导的C57BL/6J小鼠作为IPF动物模型，对中药罗勒多糖提取物治疗IPF的药效作用进行了初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8周龄C57BL/6J雄性小鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（合格证号：NO.37009200003495）;戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，用生理盐水配制成2%溶液后按照2 mL/kg体重腹腔注射;注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社生产，每瓶15mg，造模用量为1.5mg/kg。罗勒，购自山东中鲁医院。羟脯氨酸（HYP）Elisa试剂盒，由北京方程生物公司提供。

罗勒多糖的制备：称取100g罗勒药材粉碎成粗粉，依次添加10、8、8倍量蒸馏水加热回流提取3次，每次提取温度90℃，时间2h，过滤，合并，减压浓缩至适量体积，搅拌滴加总体积80%乙醇，收集沉淀，依次使用乙醇，丙酮清洗，真空冷冻干燥，得罗勒多糖，得率为9.1%，苯酚硫酸法测得多糖含量为28%。

1.2 实验动物分组、造模及给药

将40只C57BL/6J雄性小鼠，体重20±5g，温度20～25℃、湿度50%～70%状态下，普通饲料育饲3天。随机分为假手术组、模型组、罗勒多糖高、中、低剂量组，每组8只。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，钝性分离肌肉、组织直至暴露气管。按照1.5mg/kg剂量用0.1mL加样器抽取用生理盐水配制的博莱霉素溶液100μL，经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管。注入结束后将鼠板直立并立即旋转抖动，让药液在小鼠肺内均匀分布[14-15]，假手术组小鼠同法注入100μL生理盐水。缝合切口，右侧卧静置，待其自然苏醒。造模7天后开始灌胃给药，小鼠用药量按“人和动物体表面积折算的等效剂量比指表”换算，计算出小鼠日服用剂量为50mg/kg，确定该等效剂量为罗勒多糖中剂量组。模型组和假手术组灌胃生理盐水0.3mL/d、罗勒多糖高、中、低剂量组每天分别按照100、50、25mg/kg等容量灌胃罗勒多糖。连续灌胃21d，手术后第28天末次给药后2h处死小鼠，取肺组织。

1.3 病理形态学观察

小鼠处死后取肺组织，用生理盐水洗净组织表面，将肺组织置于4%多聚甲醛溶液4℃固定，石蜡包埋切片。切片脱蜡后，依次放入二甲苯脱蜡、梯度酒精和蒸馏水中复水并洗涤。之后将其中1份切片放入苏木素中浸染3min，1%盐酸酒精分化，0.6%氨水返蓝，然后放入伊红染液侵染1～3min后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，即为HE染色，用于观察小鼠肺组织病理改变。另一份用Weigert氏铁苏木素浸染5min，1%盐酸酒精分化，返蓝后，用內丽春红酸性品红液浸染5～10min，磷钼酸水溶液处理3～5min，苯胺蓝复染5min，1%冰醋酸分化处理1min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，即为Masson染色，观察小鼠肺部胶原组织面积，反应肺组织纤维化程度。

1.4 ELISA法检测肺组织HYP分泌水平

取各组小鼠相同肺叶肺组织50mg，冰浴条件下用PBS匀浆，离心取上清，采用ELISA法测定肺组织匀浆上清液中HYP含量，测定方法按照试剂盒说明书步骤进行。具体操作如下：设置标准品孔、样品孔和空白孔。标准孔中标准品用标准品稀释液稀释成5个浓度梯度;空白孔作为对照孔，不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同。每孔中加入100μL稀释后的标准品或组织匀浆样品，加入50μL酶标抗体工作液后37℃孵育60min，去离子水和稀释的洗液彻底漂洗，甩干残余洗液后在每孔中分别加入50μL显色剂A和50μL显色剂B，轻摇混匀，避光置于室温下20min，加入50μL反应终止液，轻轻摇匀后用酶标仪于450nm波长处测量各孔吸光度值（OD值）。绘制标准曲线，计算样品中HYP浓度。

1.5 数据处理

统计分析采用 SPSS17.0 进行，以±s表示计量资料，采用t检验，多组比较采用方差分析，取P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HE染色结果

假手术组小鼠肺组织结构清晰，肺泡无出血点，形态结构表现正常，胶原沉积较少;模型组小鼠肺组织炎症改变和纤维组织增生，多数肺泡腔变窄、结构破坏明显，肺泡间隔增厚;罗勒多糖提取物各组与模型组相比，胶原沉积减少，实质性病变少见，肺泡间隔略微增厚，结构较正常（图1）。

2.2 Masson染色结果

发生肺纤维化时，肺泡间细胞基质沉积，胶原纤维增多，Masson染色后绿色或蓝色面积增加。实验结果表明，与假手术组比较，模型组胶原染色面积明显增多;与模型组比较，罗勒多糖提取物各组胶原染色明显减少（图2）。

2.3 ELISA实验结果

细胞外胶原蛋白沉积是肺纤维化的主要病理改变之一。胶原蛋白中HYP比例高，检测HYP含量可以间接反映肺纤维化程度。ELISA结果显示，模型组小鼠肺组织匀浆中HYP含量明显高于假手术组，罗勒多糖三个剂量组小鼠肺组织HYP含量明显低于模型组（附表）。

3 讨论

本实验结果表明，手术切开气管内注入博莱霉素成功诱导了小鼠肺纤维化病变，模型组小鼠肺组织炎症和纤维组织变化明显，多数肺泡腔壁增厚异常、正常功能结构受损严重，肺泡间隔厚度增加，胶原染色增加，肺织织匀浆HYP含量增高。近年来，研究者们利用动物模型或细胞模型发现了多种植物多糖具有抗IPF作用[7-13]。中药罗勒作为药食两用的代表中药之一，从中分离、提取的活性成分罗勒多糖，大到在抗肿瘤相关病症、降血糖、降血脂以及抗血栓等重大疾病治疗方面，小到体外细菌抑制、调节人体免疫活性等生物疾病防御方面，都发挥了重要的生物活性[16-19]。本研究结果表明，罗勒多糖能减轻博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺部炎性细胞和纤维化程度，降低胶原蛋白的沉积，减少肺织织匀浆HYP含量。

本研究表明，罗勒多糖能够降低博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化肺部炎症和纤维化，可作为中药提取物，并成为在IPF治疗中具有潜在治愈作用的药物，为求证其药效作用，下一步应开展相关的肺纤维化动物实验以及临床研究，以求获得更详尽的药理和临床证据。此外，罗勒多糖抑制肺纤维化的作用机理也有待于进一步阐明。

目前，很多研究着重于罗勒挥发油的提取和成分分析方面，罗勒的不同提取物应用于食品、药品及化妆品领域，在国内常常作为蔬菜而被人们所食用，可作为一种新型保健食物进行深入开发。

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Abstract：Objective To study the anti-pulmonary fibrosis activity of basil polysaccharide in vitro and in vivo.Method Forty male C57BL/6J mice were randomly divided into a sham operation group，a model group，and a high，medium and low dose group of basil polysaccharide.Mice in the model group and basil polysaccharide group were injected with bleomycin （1.5mg/kg） by trachea to induce pulmonary fibrosis.The sham operation group was injected with the same amount of normal saline to make the model.The mice in the basil polysaccharide group were administrated with 100，50，and 25 mg/kg basil polysaccharides respectively.The mice in the sham operation group and the model group were orally administered with the corresponding dose of normal saline.GMice were sacrificed 28 days after modeling.Pathological sections of lung tissue were stained with HE and Masson to observe the degree of alveolar inflammation and pulmonary fibrosis.The content of hydroxyproline in lung tissue was measured by ELISA to indirectly reflect the degree of pulmonary fibrosis.Result Compared with the model group，mice with different doses of basil polysaccharides had significantly reduced collagen staining，milder alveolar septal thickening，rare regional parenchymal lesions，reduced inflammatory cell infiltration，and reduced fibrosis.The proline content decreased，and the middle and high dose groups were better than the low dose group.Conclusion Basil polysaccharide can reduce the degree of pulmonary fibrosis of mice induced by bleomycin and is a potential extract of herb medicine in treating pulmonary fibrosis.

Keywords：basil polysaccharide;pulmonary fibrosis;mice;bleomycin

（責任编辑 李婷婷）