ILK调控PLK1的表达对膀胱癌细胞恶性生物学行为的影响

高 娟,董兵卫,李 卓,王云杰,张渭波*

(1西安医学院第一附属医院检验科,西安 710077;2咸阳市中心医院病理科;*通讯作者,E-mail:15091068711@163.com)

整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。作为一种整合素和细胞质生长因子受体的效应分子,ILK能通过调节下游靶蛋白的表达,如NF-κB通路[1],基质金属蛋白酶9[2]等,参与恶性肿瘤细胞的粘连、生长、发展和血管生成[3]等过程,在恶性肿瘤的凋亡、侵袭和迁移中发挥着至关重要的作用。前期研究发现[4],高表达ILK能促进膀胱癌细胞增殖和克隆形成,并且在抗癌药物多西紫杉醇的作用下,膀胱癌细胞的凋亡减少,侵袭增加,同时,增强活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达水平。PLK1(polo-like kinase 1)是细胞有丝分裂关键的调控因子,参与调控多种生物学功能,包括细胞周期和细胞因子分泌等,其在启动、维持和有丝分裂过程中发挥重要的作用。研究表明,PLK1在黑色素瘤、皮肤梅克尔细胞癌、胰腺癌和肝癌等多种恶性肿瘤中高表达[5-8],并且PLK1的表达水平与某些癌症的预后密切相关。通过各种措施抑制PLK1表达后可以显著减少细胞增殖,促进肿瘤凋亡[5]。目前关于ILK和PLK1在膀胱癌发生、发展中的相互作用的研究较少。因此,本研究利用特异性siRNA处理降低了高表达ILK的膀胱癌5637/ILK细胞中PLK1的表达含量,探讨ILK调控PLK1的表达对膀胱癌细胞恶性生物学行为的影响,旨在为膀胱癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、细胞和试剂

T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、逆转录试剂盒、DNA marker DL600、DL2000及DL15000均购自宝生物工程(大连)有限公司;去内毒素质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司(美国);脂质体Lipofectamine 2000和Trizol试剂购自Invitrogen公司(美国);ILK过表达和针对5637/ILK细胞的PLK1 siRNA质粒,人膀胱癌5637细胞和DH5α均由西安医学院第一附属医院中心实验室保存。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒均购自上海生博医学生物工程科技有限公司;ILK抗体购自Santa cruz公司(美国);PLK1抗体购自博奥森公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37 ℃,5%CO2饱和湿度孵育箱中常规培养5637细胞,待细胞80%以上融合时进行传代。取对数生长期的细胞,按2×105个/孔接种至6孔板中,待细胞80%左右融合时,用脂质体Lipofectamine 2000将ILK过表达质粒转染5637细胞,并命名为5637/ILK组,同时,设转染空质粒的5637细胞作为阴性对照,并命名为5637/NC组,运用Western blot分别检测5637/ILK和5637/NC组中ILK的表达。常规传代培养,待细胞80%左右融合时将低表达PLK1的PLK1 siRNA质粒转染5637/ILK细胞,同时设5637/ILK细胞为阴性对照,并将实验分为5637/ILK+PLK1 siRNA组和5637/ILK组。以1.6 mg/ml的G418筛选2周后,更换含0.8 mg/ml G418的培养基维持培养,4周后获得稳定表达细胞株。

1.2.2 Western blot检测ILK和PLK1基因的蛋白表达 提取稳定转染的各组细胞总蛋白,经SDS-PAGE分离后,电转移至PVDF膜上,采用5%脱脂奶粉封闭2 h;分别加入鼠抗人ILK抗体(1 ∶300稀释)、兔抗人PLK1抗体(1 ∶750稀释),兔抗人β-actin抗体(1 ∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜;分别加入HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(1 ∶2 000稀释),37 ℃孵育1 h;用增强化学发光显色系统显色,再用Quantity one软件定量,以ILK/β-actin表示ILK蛋白的相对表达量,以PLK1/β-actin表示PLK1蛋白的相对表达量,实验重复3次。计算ILK蛋白的增高率[=(ILK蛋白相对表达量5637/ILK组/ILK蛋白相对表达量5637/NC组-1)×100%];计算PLK1蛋白的抑制率[=(1-PLK1蛋白相对表达量5637/ILK+PLK1 siRNA组/PLK1蛋白相对表达量5637/ILK组)×100%]。

1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡 取对数生长期的各组稳定转染细胞,以每孔2×105细胞接种于放有盖玻片的6孔培养板中,待细胞生长至汇合度80%左右,PBS洗3次;4%多聚甲醛固定0.5-1 h;滴加0.1%Triton×100,冰上孵育2 min;每个样品滴加50 μl TUNEL检测液,37 ℃避光孵育60 min,PBS洗3次;甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照,实验重复3次。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期的各组稳定转染细胞,接种于6孔细胞培养板中,待密度达到85%时,用10 μl的枪头在板底部划痕,更换无血清培养基。常规培养24 h后,95%乙醇固定,Gimesa染色10 min,显微镜下观察伤口愈合情况并拍照,计算细胞相对迁移能力(=0 h时划痕距离-24 h时划痕距离),实验重复3次。

1.2.5 ROS水平检测 利用活性氧检测试剂盒检测细胞中ROS水平。提取待测细胞,在PBS缓冲液中重悬至106个/ml,加入2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针,使细胞与DCFH-DA探针结合。避光37 ℃作用30 min,每隔3-5 min颠倒混匀一次;离心洗涤,重复此步骤3次以去除残留的DCFH-DA,重悬过筛后即可用流式细胞仪检测细胞中ROS水平,实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ILK基因的蛋白表达

Western blot结果显示,5637/ILK组ILK蛋白表达水平较5637/NC组明显增高,增高率为(72.36±1.58)%。且差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

图1 Western blot检测5637/NC组和5637/ILK组中ILK基因的蛋白表达水平Figure 1 ILK protein expression in 5637/NC group and 5637/ILK group by Western blot

2.2 PLK1基因的蛋白表达

Western blot结果显示,PLK1基因的蛋白表达在5637/ILK+PLK1 siRNA组明显低于5637/ILK组(P<0.05,见图2),抑制率为(68.93±2.13)%。

图2 Western blot检测5637/ILK组和5637/ILK+PLK1 siRNA组中PLK1基因的蛋白表达水平Figure 2 PLK1 protein expression in 5637/ILK group and 5637/ILK+PLK1siRNA group by Western blot

2.3 各组细胞凋亡分析

TUNEL检测结果显示,5637/ILK+PLK1 siRNA组细胞出现大量带有荧光的细胞(即凋亡细胞),而5637/ILK组仅有少量凋亡细胞出现(见图3)。细胞凋亡半定量结果显示,5637/ILK+PLK1siRNA组细胞的凋亡率与5637/ILK组相比显著增加(66.38%±0.73%vs18.65%±1.26%),差异具有统计学意义(P<0.05,见图3)。

2.4 细胞迁移能力分析

划痕实验结果显示,5637/ILK+PLK1 siRNA组细胞在24 h内迁移距离小于5637/ILK组(见图4),通过计算得出5637/ILK+PLK1 siRNA组细胞的迁移距离为(953.73±95.24)μm,而5637/ILK组细胞的迁移距离为(1 771.47±92.86)μm,结果表明siRNA PLK1可以促使5637/ILK细胞的迁移能力显著下降。

与5637/ILK组相比,*P<0.05图3 TUNEL检测5637/ILK+PLK1 siRNA和5637/ILK组细胞凋亡 (×200)Figure 3 Apoptosis in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group by TUNEL (×200)

图4 细胞划痕实验检测5637/ILK+PLK1siRNA和5637/ILK组细胞的迁移能力 (×200)Figure 4 Migration capability in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group detected by cell scratch test (×200)

2.5 ROS水平比较

ROS检测结果显示,5637/ILK+PLK1 siRNA组细胞ROS荧光强度显著低于5637/ILK组,差异具有统计学意义(t=11.62,P<0.05,见图5)。

与5637/ILK组细胞相比,*P<0.05图5 细胞活性氧检测试剂盒检测5637/ILK+PLK1siRNA和5637/ILK组ROS水平Figure 5 ROS levels in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group detected by cell active oxygen detection kit

3 讨论

从全世界的恶性肿瘤发病趋势来看,膀胱癌高居恶性肿瘤发病率的第10位,在男性恶性肿瘤中排第6位[9]。在中国,膀胱癌是发病率最高的男性恶性肿瘤之一,是发病率最高的泌尿系统肿瘤[10]。

PLK1作为丝氨酸-苏氨酸激酶家族之一,在前列腺癌[11]、神经母细胞瘤细胞[12]、急性髓性白血病[13]和宫颈癌[14]等多种恶性肿瘤中高表达,其在启动、维持和完成有丝分裂的过程中起着重要的作用,并且与生存预后关系密切,抑制PLK1表达可以通过干扰有丝分裂的多个阶段导致肿瘤细胞死亡,PLK1有望成为癌症治疗的潜在目标,PLK1特异性抑制剂BI2536已被应用于部分癌症的二期临床治疗试验[15]。有研究表明,膀胱尿路上皮癌和高侵袭性膀胱T24细胞中的PLK1表达明显高于膀胱正常组织和浅表膀胱BIU-87细胞。在增加PLK1抑制剂(scytonemin)浓度后,肿瘤细胞不仅增殖和侵袭活性明显降低,而且发生G2/M期阻滞。PLK1表达状态与重要的组织病理学特征(分级和分期)以及膀胱尿路上皮癌的复发和转移密切相关[16]。在裸鼠模型中使用PLK1抑制剂RO3280能抑制膀胱癌细胞生长和细胞周期进程,阻滞膀胱癌异种移植物生长[17]。本研究结果揭示,抑制PLK1的表达,可使过表达ILK的膀胱癌5637/ILK细胞的凋亡明显增加,迁移能力显著降低。

ROS是一种具有活性氧功能基团的化合物,其主要的产生场所是在细胞氧化系统中,主要包含氧自由基、过氧化物和激发态氧等,在病理状况下,大量的ROS对细胞的脂质、蛋白质以及DNA造成影响,导致细胞损伤[18]。PLK1是参与调控肿瘤内环境氧化应激状态的关键分子,例如,PLK1在去势抵抗性前列腺癌中异常高表达,它是氧化应激诱导的PI3K/AKT/mTOR通路激活的先决条件;类似的,PLK1可帮助急性B淋巴细胞性白血病细胞克服SYK酪氨酸激酶介导的氧化应激抵抗状态。我们前期研究发现,ILK的异常升高显著提升细胞内氧化应激状态[4]。本研究利用特异性siRNA处理降低了高表达ILK的膀胱癌5637/ILK细胞中PLK1的表达含量,结果发现膀胱癌细胞的氧化应激状态明显降低,揭示ILK可能通过直接调控PLK1的表达水平来干预膀胱癌细胞的氧化应激状态,进而促进膀胱癌细胞恶性表型的进展。

综上所述,下调PLK1的表达水平可明显逆转由于ILK过表达导致的膀胱癌细胞凋亡减少、迁移能力增加和氧化应激状态的升高,这3个功能学上的检测显示,ILK过表达所诱导的促癌效应很可能是通过对PLK1的激活作用来实现的。