氯胺酮通过增强星形胶质细胞KAT6B基因表达提高抗氧化应激水平

刘 行,陈嘉鑫,冯建国,贾 静,王晓斌

(西南医科大学附属医院麻醉科,泸州 646000;*通讯作者,E-mail:wangxiaobin67@163.com)

生理情况下,神经系统的正常氧化应激水平对维持生理功能具有重要作用,氧化应激失衡将导致神经系统功能紊乱,引起抑郁症、阿尔兹海默症等疾病[1,2]。星形胶质细胞是神经系统的重要组成部分,在神经系统中参与维持氧化应激稳定[3],其功能的改变将导致抑郁症等疾病的发生[4]。氯胺酮是一种常用的麻醉药物,可以增加抗氧化应激能力[5],在临床麻醉、镇痛及快速抗抑郁领域有重要作用[6,7],但是其在星形胶质细胞是否具有抗氧化应激的作用及其作用机制不清楚。本研究检测氯胺酮对与氧化应激有关的蛋白乙酰化、KAT6B以及经典氧化应激通路Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)等的作用,以阐释氯胺酮提高星形胶质细胞抗氧化应激能力的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒及总超氧化物歧化酶测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所;DMEM细胞培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶消化液及BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司;β-actin、Nrf2抗体、羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗购自中国Proteintech公司;KAT6B购自英国Abcam公司;Western blot乙酰化抗体购自中国景杰生物科技公司;免疫荧光乙酰化抗体购自美国Santa Cruz公司;TRNzol总RNA提取液、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)购自中国天根生化公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit购自德国QIAGEN公司;RT-qPCR引物购自中国深圳华大基因公司;KAT6B siRNA和空白对照片段购自中国吉玛制药公司;Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养

人星形胶质细胞株HA1800购自武汉博士德生物公司,培养条件为高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg链霉素,37 ℃和5%CO2。

1.3 氧化应激相关酶活力测定

HA1800细胞经50 μmol/L氯胺酮处理12 h,细胞刮挂取细胞,于4 ℃ 3 000 r/min离心10 min后取上清液。按照试剂盒说明书进行,采用比色法测定GSH-Px活力,WST-1法测定T-SOD活力,钼酸胺法测定CAT活力。

1.4 Western blot检测Nrf2、乙酰化及KAT6B蛋白表达

50 μmol/L氯胺酮处理HA1800细胞3,6,12,24 h,刮取细胞,用裂解液RIPA于冰上裂解30 min,在4 ℃下12 000 r/min离心15 min后取上清液,BCA法测定蛋白浓度,蛋白样品加入上样缓冲液,100 ℃蛋白变性,行SDS-PAGE电泳。以每孔20 μg上样,蛋白电泳结束后,采用湿转法将蛋白至NC膜,于含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1 h,加入一抗(稀释比例分别为:β-actin 1 ∶5 000,Nrf2 1 ∶1 000,KAT6B 1 ∶1 000,乙酰化1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后室温孵育相应二抗(稀释比例分别为:羊抗鼠二抗1 ∶2 500,羊抗兔二抗1 ∶5 000)1 h,ECL化学发光法进行蛋白条带显影。将所得蛋白条带用Image J进行灰度值数据分析。

1.5 免疫荧光染色检测乙酰化及Nrf2蛋白表达

免疫荧光染色用于检测乙酰化的表达情况及Nrf2蛋白的亚细胞定位。细胞经氯胺酮处理12 h,经4%多聚甲醛固定30 min,0.2% Triton X-100破膜处理15 min,1%BSA室温封闭30 min,加入一抗4 ℃孵育过夜,PBS洗3次后室温避光孵育二抗1 h,DAPI染核5 min,经PBS洗3次后加入抗猝灭剂,荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.6 实时荧光定量PCR检测KAT6B mRNA及circRNA表达

经氯胺酮(50 μmol/L)处理12 h的HA1800细胞,采用TRNzol试剂提取总RNA,FastQuant cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录成cDNA,使用QuantiNovaTMSYBR®Green PCR Kit(QIAGEN)试剂进行实时荧光定量PCR。反应条件:95 ℃预变性600 s;95 ℃ 15 s变性,60 ℃ 40 s退火,95℃ 10 s延伸,重复40个循环;最后在72 ℃条件下延时5 min。KAT6B mRNA的引物序列:正义5′-ACAACAACAGGGGGACACAA-3′,反义5′-CCGCATGGCAGATTCTCTCT-3′;KAT6B circRNA的引物序列:正义5′-TGGGAGGTTACTGAAAGACGG-3′,反义5′-AGGCAATGTTGATGGTTGTCTTA-3′;以GAPDH为内参基因,引物序列:正义5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反义5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。结果采用2-ΔΔCt法进行KAT6B mRNA及circRNA含量的相对定量计算。

1.7 siRNA抑制KAT6B mRNA的表达

HA1800细胞接种于6孔板中,培养至融合度达到70%左右进行细胞转染,按照转染试剂盒说明书进行,更换Opti-MEM培养基,加入siRNA9.4 μl,混匀,加入Lipofectamine 3000转染试剂3.75 μl,加入混合好的转染复合物,摇匀,常温下作用15 min,继续培养,4 h后更换为完全培养基。转染后24 h,使用Western blot检测干扰效果,使用转染后的细胞进行相关实验。共设4组:对照组(siRNA-NC组,即NC组)、氯胺酮处理组(siRNA-NC+50 μmol/L氯胺酮处理12 h组,即NC+K组)、KAT6B基因转染组(siRNA-KAT6B组,即S组)和KAT6B基因转染+氯胺酮处理组(siRNA-KAT6B+50 μmol/L氯胺酮处理12 h组,即S+K组)。处理后分别按照方法1.3和1.4步骤测定Nrf2和乙酰化蛋白的表达情况,并测定T-SOD和CAT活力的变化。

1.8 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示,采用Graphpad Prism软件进行数据处理,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均至少重复3次。

2 结果

2.1 氯胺酮对星形胶质细胞氧化应激水平的影响

HA1800细胞经过50 μmol/L氯胺酮处理12 h后,GSH-Px(P=0.022 3)、T-SOD(P=0.020 0)和CAT(P=0.045 3)活力明显升高(见图1)。

2.2 氯胺酮对星形胶质细胞Nrf2、KAT6B及乙酰化表达水平的影响

50 μmol/L氯胺酮处理HA1800细胞后,结果显示Nrf2、KAT6B和乙酰化水平均显著提高(Nrf2:F(4,10)=93.53,P<0.000 1;KAT6B:F(4,10)=43.79,P<0.000 1;乙酰化:F(4,10)=40.51,P<0.000 1,见图2)。免疫荧光结果分析也发现与0 μmol/L比较,50 μmol/L氯胺酮处理星形胶质细胞12 h,乙酰化表达明显增加(P=0.032 0,见图3);使用50 μmol/L氯胺酮处理HA1800细胞12 h,Nrf2蛋白聚集于细胞核周围(见图4),提示该蛋白出现核转移现象。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图1 氯胺酮对HA800细胞抗氧化应激酶活力的影响Figure 1 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities of HA1800 cells

与0 μmol/L比较,*P<0.05,**P<0.01图5 氯胺酮对HA1800细胞KAT6B mRNA及circRNA含量的影响Figure 5 Effects of ketamine treatment on KAT6B mRNA and circRNA in HA1800 cells.

与0 h比较,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1图2 50 μmol/L氯胺酮作用不同时间对HA1800细胞Nrf2、KAT6B及乙酰化蛋白表达的影响Figure 2 The effects of 50 μmol/L ketamine on the expression of Nrf2, KAT6B and acetylation protein inHA1800 cells

图3 免疫荧光染色显示氯胺酮对HA1800细胞乙酰化表达的影响Figure 3 Effect of ketamine on the expression of acetylation inHA1800 cells by immunofluorescence

图4 氯胺酮调节Nrf2蛋白在HA1800细胞中的亚细胞定位Figure 4 Eeffect of ketamine on subcellular location of Nrf2 in HA1800 cells

2.3 氯胺酮对HA1800细胞内KAT6B mRNA及circRNA含量的影响

50 μmol/L氯胺酮处理12 h,HA1800细胞内KAT6B mRNA含量明显增加(P=0.002),KAT6B circRNA含量明显降低(P=0.016 4,见图5)。

2.4 沉默KAT6B基因降低氯胺酮对星形胶质细胞的抗氧化应激能力的作用

抑制KAT6B基因表达(F(3,8)=135.62,P<0.000 1)之后,HA1800细胞内Nrf2(F(3,8)=51.78,P<0.000 1);乙酰化(F(3,8)=102.52,P<0.000 1)的含量及抗氧化应激相关酶(T-SOD:F(3,8)=195.62,P<0.000 1;CAT:F(3,8)=106.49,P<0.000 1)的活力明显变化(见图6,7)。与NC+K组比较,S+K组Nrf2(P<0.000 1)、乙酰化(P=0.033)的含量及T-SOD(P=0.005 5)、CAT(P<0.000 1)的活力均明显降低(见图6,7)。

NC组:siRNA-NC组;NC+K组:氯胺酮处理组;S组:KAT6B基因转染组;S+K组:KAT6B基因转染+氯胺酮处理组;与NC组比较,***P<0.001,****P<0.000 1;与NC+K组比较,#P<0.05,####P<0.000 1图6 氯胺酮对KAT6B基因沉默后HA1800细胞KAT6B、Nrf2及乙酰化蛋白的影响Figure 6 Effects of ketamine treatment on KAT6B, Nrf2 and acetylation protein expression after silencing KAT6B gene in HA1800 cells

NC组:siRNA-NC组;NC+K组:氯胺酮处理组;S组:KAT6B基因转染组;S+K组:KAT6B基因转染+氯胺酮处理组;与NC组比较,**P<0.01,****P<0.000 1;与NC+K组比较,##P<0.01,####P<0.000 1图7 氯胺酮对KAT6B基因沉默后HA1800细胞抗氧化应激酶活力的影响Figure 7 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities after KAT6B gene silencing in HA1800 cells

3 讨论

目前临床常用的抗抑郁药物存在起效慢、抗抑郁效果不稳定等不足,迫切需要新的快速起效的抗抑郁药物[8],氯胺酮因其快速而明显的抗抑郁作用受到越来越多的关注[9]。但具体通过什么途径发挥抗抑郁作用仍不清楚,阐明相关信号通路,对于开发新的快速起效的抗抑郁新药具有重要指导作用。

星形胶质细胞对中枢神经系统的发育和相关功能具有密切联系,可通过离子通道、能量代谢、神经细胞营养支持等途径参与抑郁症的发生和发展[10,11]。胡海岚等[12]的研究表明,抑郁症大鼠模型的外侧僵核的星形胶质细胞钾通道(Kir4.1)被上调,可能作为治疗抑郁症的靶点。此外,Cotter等[11]的研究显示,星形胶质细胞供给能量不足时,会减少神经细胞树突分枝,增加神经元的易损性及对抑郁症的易感性。此外,氧化应激水平增加对抑郁症的发生有促进作用[13]。在抑郁大鼠模型体内SOD、CAT活力降低,且在使用S-氯胺酮之后,SOD、CAT的活力增加[5]。并且抑郁症患者在接受抗抑郁药物治疗前,血清内丙二醛(MDA)含量增加[14]。研究结果表明50 μmol/L氯胺酮明显增加了人星形胶质细胞内抗氧化应激酶GSH-Px、SOD和CAT的活力,证实氯胺酮可增加抗氧化应激酶的活力,但具体机制需进一步探讨。

已有研究证实,Nrf2在阿尔茨海默氏症、帕金森病等神经退行性疾病中被激活,而在体外培养的神经元中,Nrf2活性被抑制,只有培养的星形胶质细胞对Nrf2激活剂产生反应[15],提示Nrf2与星形胶质细胞具有密切的联系。Nrf2蛋白可结合DNA上游调节区的抗氧化反应元件,是机体抗氧化应激水平的重要调节因子[16]。本实验结果表明,氯胺酮处理星形胶质细胞后,抗氧化应激酶的活力和Nrf2蛋白的表达增加,但氯胺酮引起Nrf2蛋白表达增加的具体机制尚不明确。

研究表明,乙酰化水平和Nrf2表达密切相关[17]。通过p300/CBP途径使Nrf2的乙酰化水平增加能够促进抗氧化应激反应中Nrf2序列的启动子结合,从而诱导机体的抗氧化应激水平增加[18]。此外,组蛋白去乙酰化抑制剂丙戊酸可以通过恢复组蛋白乙酰化水平,改善Nrf2介导的抗氧化防御机制破坏所导致的抑郁症[17]。本研究结果表明氯胺酮可明显提高星形胶质细胞乙酰化水平。但氯胺酮通过什么途径影响乙酰化水平还不清楚。

KAT6B基因的表达产物是一种乙酰基转移酶,其表达水平可调节机体乙酰化水平。最近研究显示,环状RNA的形成机制主要为RNA反向剪切,在前体RNA形成环状RNA的过程中,可导致编码蛋白质的线状RNA减少,即环状RNA与线状RNA的产生存在着竞争关系[19]。前期研究结果表明[20],氯胺酮处理后,大鼠海马组织内rno-circRNA-005442表达降低,且该环状RNA与KAT6B基因同源。检测氯胺酮处理后KAT6B基因表达的结果发现,线状RNA含量明显降低,环状RNA含量明显增加,且沉默KAT6B基因的表达后,Nrf2、乙酰化蛋白表达降低,T-SOD和CAT活性降低。实验结果证实氯胺酮致KAT6B表达增加与氯胺酮减少环状KAT6B形成相关。

综上所述,氯胺酮可通过调节KAT6B基因的表达,提高乙酰化水平,促进Nrf2表达,增加抗氧化应激酶的活力,最终提高星形胶质细胞抗氧化应激能力。