非小细胞肺癌组织中HAb18G、MMP-9和MMP-2表达与预后的相关性

赵天源，张艳敏，常延河

近年随着空气污染、人口老龄化等原因的日渐加重，肺癌患病率和病死率位居恶性肿瘤的首位[1]。肺癌中最常见病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其恶性程度较高，侵袭和转移是造成预后不良的主要原因，因此探讨与肿瘤侵袭和转移的相关分子指标具有重要的意义。在多种肿瘤中HAb18G能够诱导MMP-9、MMP-2表达等，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移[2]，但在肺癌中的表达鲜见报道。本文着重探讨HAb18G、MMP-9和MMP-2的表达与NSCLC转移和预后的关系，为NSCLC的早期诊断和预后判断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2002年1月～2013年5月河北省唐山市开滦总医院手术切除的原发性NSCLC石蜡标本121例，其中男性98例，女性23例；≤50岁者45例，>50岁者76例；肿瘤直径≤3 cm者86例，>3 cm者35例；病理类型：鳞癌61例，腺癌60例；组织学分化程度：高+中分化89例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期56例；无淋巴结转移者54例，有淋巴结转移者67例。所有患者均经病理确诊，临床病理资料均完整，术前患者均未行放、化疗及免疫治疗。

1.2 主要试剂HAb18G单抗和相关免疫组化试剂盒，购自江苏太平洋美诺克公司。鼠抗人MMP-9单克隆抗体和免疫组化试剂盒，购自福州迈新公司。鼠抗人MMP-2单克隆抗体和免疫组化试剂盒，购自武汉博士德公司。

1.3 方法采用免疫组化SP法染色，将121例NSCLC石蜡包埋块常规脱蜡、水化，3%H2O2，微波抗原修复，10%正常羊血清封闭。分别滴加HAb18G(1 ∶200)、MMP-9(1 ∶200)和MMP-2(1 ∶200)抗体，4 ℃过夜，滴加辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG，37 ℃ 1 h，DAB显色，苏木精复染，透明树胶封固。用PBS代替一抗作阴性对照，取阳性对照片同步操作做阳性对照。通过查阅病案资料、电话等方式对患者进行术后5年生存期调查，利用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验分析三者的表达水平与患者生存期的关系。

1.4 结果判读HAb18G、MMP-9和MMP-2的阳性细胞为肿瘤细胞膜或胞质呈棕黄色，在高倍镜视野下选取4个不同视野，分别计数200个细胞，无阳性细胞为(-)；阳性细胞<30%为(+)；30%～50%为()；>50%为()。以(～)为阳性。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。免疫组化结果采用χ2检验和Fisher确切概率法进行分析，利用GraphPad Prims软件绘制Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验分析患者HAb18G、MMP-9和MMP-2表达水平与生存期的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表达与临床病理特征的关系HAb18G(图1、2)、MMP-9(图3、4)和MMP-2(图5、6)在NSCLC组织中的阳性率分别为71.07%、41.32%和55.37%。HAb18G蛋白表达与患者性别、年龄和病理类型无关(P>0.05)；在肿瘤直径>3 cm组、低分化组、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组表达分别高于肿瘤直径≤3 cm组、高+中分化组、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组(P<0.05)。MMP-9和MMP-2蛋白表达与患者性别、年龄和分化程度无关(P>0.05)；在肿瘤直径>3 cm组、腺癌组、低分化组、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组中的表达分别高于肿瘤直径≤3 cm组、鳞癌组、高+中分化组、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组(P<0.05，表1)。

①②③④⑤⑥

表1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表达与临床病理特征的关系

2.2 NSCLC组织中HAb18G与MMP-9和MMP-2表达的相关性将NSCLC组织中HAb18G蛋白表达和MMP-9蛋白表达进行相关分析，结果显示：HAb18G蛋白表达和MMP-9蛋白表达呈正相关(r=0.313，P<0.001)；将NSCLC组织中HAb18G蛋白表达和MMP-2蛋白表达进行相关分析，结果显示：HAb18G蛋白表达和MMP-2蛋白表达呈正相关(r=0.268，P<0.05)。

2.3 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表达与预后的关系Kaplan-Meier生存分析结果显示：高表达HAb18G患者术后5年生存率(12.79%)显著低于低表达者(42.86%)(P<0.01)；高表达MMP-9患者术后5年生存率(14.00%)显著低于低表达者(23.94%)(P<0.01)；高表达

图7 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表达与预后的关系

表2 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表达与预后的关系

3 讨论

肺癌作为全球高发恶性肿瘤，相关调查研究结果显示其生存率不足20%[3]，因此对其侵袭及转移机制的研究成为当今热点之一。肿瘤的侵袭、转移相关机制是由多因素、多步骤、多基因共同参与的复杂过程。

基质金属蛋白酶是一组与锌结合的内肽酶，能降解大部分细胞外基质成分，促进肿瘤细胞突破正常组织学屏障，侵袭邻近组织和发生远处转移。其中，MMP-2和MMP-9与肿瘤的侵袭转移关系最为密切。MMP-2(又称Ⅳ型胶原酶)与MMP-9均由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌，共同参与降解Ⅳ型胶原及纤维黏连蛋白等基膜和细胞外基质成分，其中MMP-9对肿瘤细胞的黏附能力也具有一定的作用[4]。两者在多种肿瘤中均有表达。Liu等[5]研究表明，抑制MMP-2的通路与前列腺癌患者病情进展及预后密切相关。Ciucă等[6]的研究结果表明，在54例舌鳞癌组织中，MMP-9和MMP-2在转移淋巴结中强表达，提示它们在局部浸润和转移过程中有着重要意义。Jeleniewicz等[7]发现对MMP-9和MMP-2 mRNA表达水平的检测可对卵巢癌患者的化疗效果进行评价。本组实验发现，MMP-9和MMP-2在肿瘤直径>3 cm组、腺癌组、低分化组、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组的表达分别高于肿瘤直径≤3 cm组、鳞癌组、高+中分化组、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组(P<0.05)。这与Zhang等[8]的研究结果一致。Ni等[9-10]的研究结果均证实高水平的MMP促使肿瘤细胞发生浸润与转移，并与患者的生存期密切相关。

HAb18G是肝癌单克隆抗体HAb18的相应膜抗原(是一种高度糖基化、相对分子质量为5.8×104的跨膜蛋白)，作为新型肿瘤抗原之一，属于免疫球蛋白家族成员，在人体中分布广泛，参与胚胎发育、器官形成及炎症反应，并在多种上皮组织起源的肿瘤中表达，进而参与肿瘤的侵袭和转移等病理过程。其作用机制为诱导肿瘤细胞和间质成纤维细胞产生多种基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-11等)使细胞外基质降解，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移。本实验显示，HAb18G在肿瘤直径>3 cm组、低分化组、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组中的表达分别高于肿瘤直径≤3 cm组、高+中分化组、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组(P<0.05)，且低表达患者生存率明显高于高表达组(P<0.05)。崔丽萍等[11]的研究结果亦显示，HAb18G的表达与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，证实NSCLC中HAb18G表达与其病理特征、转移及预后有一定的关系，可作为疾病发生、发展的重要参考指标。因此，可将HAb18G作为判断NSCLC的预后情况指标。

本实验结合HAb18G、MMP-9和MMP-2三种检测指标，弥补单一指标易出现偏差性的缺点，且经过相关性分析，验证HAb18G与MMP-9和MMP-2表达呈正相关，综合分析三者的表达水平与NSCLC的各项临床病理特征及与预后的关系，为临床提供了有价值的早期诊断与预后分析的参考指标，其相关分子通路问题有待于进一步分析。