Taqman探针RT-qPCR法检测柑橘黄龙病与海南柑橘主产区黄龙病现状

李 欢， 康秀晗， 李德飞， 陈惠查， 黄家权

(1.贵州省农业科学院 农作物品种资源研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.海南省众邑新材料研究院有限公司， 海南 三亚 572025； 3.海南大学 热带作物学院海南省热带生物可持续利用重点实验室， 海南 海口 570228； 4.贵州省威宁自治县黑石头镇第二小学， 贵州 威宁 553105)

柑橘黄龙病(HLB)又叫青果病，是世界柑橘生产中毁灭性的病害之一，有柑橘“癌症”之称，感病果园通常在5～8年内就会全园覆灭，目前该病已在全球超过40多个国家和地区流行[1]。黄龙病的病原物是一种难以培养的韧皮部杆菌属革兰氏阴性菌[2]，目前已知的黄龙病菌有亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、非洲种(Ca. L. africanus, Laf)和美洲种(Ca. L. americanus, Lam)3个种[3]，其中Las分布最广，也是我国柑橘黄龙病发生的致病种[4]。柑橘黄龙病主要通过带病接穗嫁接和柑橘木虱交叉取食传播[5]，其中Las和Lam主要通过亚洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)、Laf主要通过非洲柑橘木虱(Triozaerytreae)传播[6]。目前对柑橘黄龙病的病原菌虽已有统一的认识，但由于黄龙病菌尚未实现体外人工培养，对其生物学特性知之甚少，导致抗病品种和有效药剂缺乏，对柑橘黄龙病的控制仅限于预防水平。同时，柑橘黄龙病典型症状包括果实出现“红鼻子果”[7]、叶片均匀或斑驳黄化[1]等，这与一些缺锌、缺镁等缺素症，以及病毒病危害症状相似，因此，黄龙病症状诊断具有较大的主观性。建立快速、有效、准确的分子检测和诊断方法，有助于及早清除病原，防止黄龙病扩散蔓延。同时，研究黄龙病菌在不同自然气候条件下寄主植物体内的分布和含量水平，有助于加深对其生物学特性及其在寄主植物体内扩散定殖特性和致病机理的研究。

由于病原菌在宿主植株内的低含量、不均匀分布等，使得传统的PCR方法对黄龙病菌在宿主植株或者昆虫体内的持续检测无论是在准确性还是灵敏性等方面都存在缺陷[8-9]。LI等[10]的研究表明：利用Taqman探针的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技术检测黄龙病菌与传统PCR相比，具有高灵敏度、特异性、准确性和稳定性，高重复率和低污染等优点，且RT-qPCR可对DNA进行定性定量的检测和分析，因此该方法是研究确诊与检测黄龙病菌在宿主植株体内含量和分布的有效手段。TEIXEIRA等[11]在圣保罗州和巴西两地对甜橙叶片进行黄龙病美洲种(Lam)的检测后发现，其在叶片中分布不均，在无症状的叶片中未检测出黄龙病菌，而在斑驳型黄化症状的叶片中检测出较高浓度的黄龙病菌，中脉组织中平均含量达到107个/g。TATINENI等[12]发现感病柑橘根、皮、叶、花、果实中均含有黄龙病菌，而在种子胚胎和胚乳中未能发现。LI等[13]研究发现黄龙病菌可以感染柑橘植株多个组织，且在不同组织中含量差异巨大，地上部组织中平均含量达1010个/g，病菌含量从接种位点向上下两侧逐渐蔓延增多。

我国南方地区柑橘黄龙病发生严重，随着海南省柑橘种植面积的不断扩大，面临的潜在威胁也越来越大。针对海南省柑橘黄龙病的发生状况，笔者参考LI等[10]的方法，以植物细胞色素氧化酶(COX)引物探针组(COXfpr)为内参，用黄龙病特异的引物探针组(HLBaspr)对海南省不同品种、不同组织部位的Las进行实时荧光定量检测分析，以期建立一种不依赖于症状的高准确性HLB分子诊断方法，了解海南省柑橘黄龙病的整体分布概况，供研究黄龙病菌在柑橘体内发生发展规律参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年4—5月对海南省临高县新盈农场的5年生红肉蜜柚、澄迈县福山果园的10年生红江橙各选4株疑似黄龙病株，每株按新叶、老叶、新梢、茎秆、次级根、主根等分部位取样，其中叶片按显症(斑驳黄化型)和不显症(表型正常)分类采集；对琼中县、屯昌县、儋州市的柑橘园各选4株疑似黄龙病株的显症或不显症叶片取样，并以琼中县苗圃基地种植于温室大棚的红江橙作阴性对照。

1.2 样品总DNA提取

用清水将植株组织冲洗干净，分别称取200 mg(叶片取中脉，新梢、茎秆取表皮)。采用TIANGEN公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒(DNAsecure Plant Kit，DP320)提取各组织样品的DNA，悬浮于150 μL TE洗脱缓冲液中，-20℃保存待用。用Nanodrop 2000-超微量分光光度计测定提取的DNA浓度。

1.3 RT-qPCR检测病原菌

qPCR参照LI等[10]的方法并稍作修改。黄龙病引物为HLBas/HLBr，探针为HLBp；内参基因引物为COXf/COXr，探针为COXp。反应体系为20 μL: 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) : 10 μL，250 nM黄龙病引物HLBas/HLBr:各0.5 μL，150 nM探针HLBp:0.3 μL，300 nM内参引物COXf/COXr:各0.3 μL，150 nM内参探针:0.3 μL，DNA模板:5 μL。扩增程序为：95℃变性20 s，然后95℃ 1 s，58℃ 40 s，共50个循环。每个DNA样品重复测定3次，每次测定均带1个空白对照、阳性对照和阴性对照。使用德国QIAGEN生产的Rotor-Gene Q仪器进行Rt-qPCR，各引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成，qPCR试剂购自日本TaKaRa公司。

1.4 Las浓度计算

采用LI等[14]的广谱线性回归方程：Y=13.82-0.286 6X对Las进行定量分析。其中Y代表DNA模板浓度的Lg值，X代表RT-qPCR后的荧光阈值(CT值)，由于qPCR中5 μL的DNA模板是从200 mg植株组织中提取的并悬浮于150 μL TE洗脱缓冲液中，且基于Las 16S rDNA设计的序列中，每个病原菌细胞中含有2份靶DNA，故最终Las的浓度为10Y×150×5/2(个/g)。

1.5 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0软件进行统计分析，应用Duncan法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 RT-qPCR检测Las

对感染了Las的临高红肉蜜柚样品DNA进行10倍的连续浓度梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释(表1)后进行qPCR。检测结果表明：HLBaspr引物探针组在DNA稀释到10-5时，每5 μL DNA中仍能检测到Las(图1)，而稀释到10-6时则收集不到荧光信号。因此，使用HLBaspr引物探针组对黄龙病的检测下限为10-5稀释度，相当于每67 ng新鲜叶片中脉组织中含有一个靶DNA(200 mg÷150 μL×10-5×5 μL)，即Las在叶中脉组织的含量约1.49×107份DNA/g。

表1 实时荧光定量PCR(Taqman)的灵敏度检测

2.2 Las在红肉蜜柚和红江橙各部位中的含量

对临高县的红肉蜜柚和澄迈县的红江橙2品种各3株疑似黄龙病感病植株按主根、次级根、茎、新梢、老叶、新叶6个部位取样进行qPCR。检测结果(表2)表明：红肉蜜柚和红江橙植株各部位均可检测出Las病原菌，且各部位Las的含量差异较大。红肉蜜柚各部位Las的含量从次级根、老叶、主根、新叶、茎、新梢依次降低，差异水平在4个数量级内变化(图2)，变化范围从1×107个/g～3×1011个/g，其中次级根含量达2.31×1011个/g，新梢含量为1.15×107个/g；红江橙各部位Las含量从新叶、老叶、新梢、茎、次级根、主根依次降低，差异水平在3个数量级内变化，变化范围从1×109个/g～4×1011个/g，其中新叶含量达3.65×1011个/g，主根含量为1.51×109个/g。从整体结果看，红肉蜜柚各部位COXfpr的CT值较稳定且正常，而红江橙主根和次级根COXfpr的CT值偏高，这可能与感病植株部分根死亡，DNA被降解，致检测条件下的基因组DNA的浓度相对较低有关。

表2 RT-qPCR 定量检测红肉蜜柚和红江橙不同组织中黄龙病菌的循环阈值及其含量

2.3 黄龙病显症与不显症叶片中Las的含量

对采自临高县的红肉蜜柚和澄迈县的红江橙2个品种的斑驳黄化型与表型正常的老叶、新叶中脉进行qPCR检测结果表明(图3)：2个品种的新叶和老叶中脉均能检测出Las，且斑驳黄化型叶片Las含量高于表型正常叶片，含量差异在老叶中表现得尤为突出，斑驳黄化型较表型正常老叶高出104～106倍，新叶则仅高出10～100倍。红江橙新叶Las含量高于红肉蜜柚，老叶中二者含量相差不大。

2.4 海南省柑橘黄龙病的qPCR检测

采用Taqman探针RT-qPCR法对海南省琼中县、澄迈县、屯昌县、临高县、儋州市等柑橘主产区主栽的红肉蜜柚、水晶蜜柚、甜橙、福橙、柠檬等品种的疑似黄龙病样品进行检测的结果表明(表3)：在主产区采集的23个疑似黄龙病样品DNA样品中，只有来自儋州市的其中1份水晶蜜柚样品检测呈阴性，其余的样品中均检测出了黄龙病菌，Ct值介于16～31.78。说明海南省柑橘主栽区均受到了不同程度的黄龙病菌危害。

表3 RT-qPCR对海南省柑橘黄龙病疑似样品检测循环阈值

3 结论与讨论

1) 本研究应用Taqman探针qPCR法在海南省感病红肉蜜柚和红江橙的主根、次级根、茎、新梢、老叶、新叶等6个组织中都检测出Las，且Las在各组织或同一组织不同品种间的含量差异较大，与TATINENI等[12]、LI等[13]、娄兵海等[15]研究的分布、定殖特性一致。LI[13]的研究表明Las的含量在103范围内波动，不同组织中平均含量介于7×108～2×1011个/g，而本研究发现Las在不同组织中含量差异显著，平均含量在104个/g范围内波动，介于1×107～3×1011个/g，且红肉蜜柚中次级根的Las含量最高，红江橙新叶中脉的Las含量最高，原因可能是由于柑橘品种以及所处发病时期不同引起的差异。TEIXEIRA等[11]对斑驳黄化型和表型正常型叶片进行了Lam的检测，发现在不同显症叶片中黄龙病菌分布差异巨大，且斑驳黄化型叶片含量较高，与本研究结果相一致。但TEIXEIRA等[11]的研究仅在斑驳黄化型叶片中检测到Lam，而在无症状叶片中并未检测出，本研究在红肉蜜柚和红江橙2个品种的斑驳黄化型和表型正常型的新叶和老叶中均检测出了Las，且斑驳黄化型叶片Las含量均高于表型正常叶片，该结果的差异可能是试验品种、取样时间和检测方法不同导致。

2) 黄龙病叶片是否斑驳黄化和有“红鼻子”果出现，通常是田间快速诊断的依据，但LOPES等[16]研究认为，斑驳黄化症状在高温时会消退而影响诊断。LI等[10]、胡浩等[17]研究表明，Taqman探针法较传统的PCR和SYBR Green I荧光染料法有更高的灵敏度、特异性和准确性，本研究采用Taqman探针法检测Las的极限为10-5稀释度，与LI等[10]的结果一致，而与胡浩等[17]的检测极限10-8稀释度存在差异，可能是因品种差异造成。

3) 关于Las的浓度计算，采用LI等[14]证明的对不同地区、不同柑橘品种和不同组织部位都适用的广谱线性回归方程进行定量。ZHANG等[18]研究认为，使用该定量方法，当CT值大于36.0时，即视为检测结果为阴性。本次检测中仅1份样品(儋州水晶蜜柚CT= 38.55)CT值大于36.0，即检测结果为阴性，可认为该样品尚未感染黄龙病菌。

4) 海南省是优良柑橘种植区，柑橘产业是拉动地方经济发展不可或缺的产业，因此对柑橘黄龙病这种毁灭性病害进行检测，为预防该病流行有深远意义。检测发现Las已在海南各柑橘产区出现，且情况严重。本研究使用的Taqman探针RT-qPCR法可快速、精准的检测海南省柑橘Las，可作为一种稳定可靠的检验检疫技术推广应用。