泸定县主产区油菜核酸检测分析

李 忆

(1.四川民族学院 农学院， 四川 康定 626001； 2.川藏滇青林草抚育和利用研究中心, 四川 康定 626001)

油菜是我国重要的油料作物之一，对油菜的改良有传统育种和现代分子生物学育种改良2种方法。利用现代分子生物学技术，将某些生物的特定基因转移到油菜中去，使其出现油菜不具有的农艺性状或产物，此类统称为转基因油菜，转基因油菜可抗除草剂、抗病虫害等。而以转基因作物作为原料进行生产、加工得到的食品被称为转基因作物食品[1]。随着基因工程研究不断发展，许多转基因植物如抗病毒木瓜、棉花等开始大面积种植、销售。由于转基因作物不是自然产物，安全风险存在争论，并且受到了各国政府的高度重视，并要求对不符合自己规定阈值的产品进行标识[2]。我国对转基因技术管理严格，产品中含有某种转基因成分必须标识[3]。我国政府相关职能部门每年对省市县作物产品进行不定期抽查监督，但由于目前转基因检测尚处于起步阶段，很多检测机构、设施及相关配套资金不足，使得检测范围、区域有限。笔者选择甘孜州泸定县区域内售卖油菜种子或者种植油菜籽粒作为抽取对象，随机抽取泸定县农资市场售卖的油菜种子样品6份，种植油菜成熟籽粒样品12份，采用相关国家或行业标准对样品进行了定性PCR核酸检测分析，以期为该县售卖和种植油菜的转基因检测调查提供数据，并为政府制定相关转基因食品安全政策提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

油菜转基因材料购自欧盟标准物质和计量研究所(IRRM)，待测样品均为随机抽取甘孜州泸定县油菜主产区内售卖的油菜种子或种植的油菜籽粒。

1.2 主要试剂

PCR扩增引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成；植物基因组提取试剂盒、Master Mix、标准分子量(M)购于成都博瑞克生物技术有限公司；CTAB、SDS等生化试剂均为国产分析纯。

1.3 核酸抽提

样品核酸抽提按照植物基因组提取试剂盒方法进行[4]。

1.4 PCR检测

1.4.1 基因及引物 根据转基因油菜调控元件选择油菜中常用的外源基因花椰菜花叶病毒启动子(P-CaMV 35S)、玄参花叶病毒启动子(P-FMV 35S)、花椰菜花叶病毒终止子(T-CaMV 35S)和豌豆的核酮糖-1,5二磷酸羧化酶E9基因小亚基3′端序列终止子(T-E9 3′)4个基因作为筛查检测基因，特异性引物序列引用国家、行业相关标准或自设序列(表1)。将各检测基因上下游引物浓度稀释为10 μmol/L。

表1 引物序列、扩增片段长度及检测依据

1.4.2 PCR产物 反应体系东洋纺2×Master Mix 10 μL，上下游引物F、R各0.8 μL，样品DNA模板1.5 μL，加双蒸水至20 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；94℃变性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s，35个循环；72℃保持3 min，4℃保存。

1.5 电泳峰值

PCR反应结束后，核酸通过超微量分光光度计测定浓度，并将其浓度稀释至25 ng/μL，经过定性PCR反应扩增，扩增产物经过Qiagen QIAxcel Advanced毛细管电泳仪进行分离分析，获得外源基因的电泳峰值典型图谱。

2 结果与分析

由表2和图1～5外源基因的电泳峰值典型图谱可见，18份油菜样品未检测到油菜外源基因P-FMV 35S(172 bp)、P-CaMV 35S(195 bp)、T-CaMV 35S(134 bp)、T-E9 3′(265 bp)。

表2 样品信息及外源基因

3 结论与讨论

分析样品为种子或籽粒，总DNA提取纯化均相对容易且含量丰富，样品的选定为核酸分析工作奠定了良好的基础。为了提高转基因检测的分析效果，研究采用分辨率更高、峰图更直观、清晰的毛细管电泳引入到PCR检测体系中。目前毛细管电泳技术已广泛应用于无机及有机化合物、蛋白质、氨基酸、肽、核酸的分离分析等方面[6-7]。通过典型图谱可以看到毛细管电泳的峰形图好，有利于分析研究，此分析方法分辨率可达2～3个碱基，但由于分辨率太高，校准条带的微小偏差将导致有的目标峰与实际峰偏差1～2个碱基，均属于误差范围内，可认为是同一物质，如需进一步判断物质的准确性可通过核酸序列分析。

2018年是生物技术/转基因作物商业化的第23年，据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)统计全球共26个国家1 700万名农民种植了1.917亿hm2的转基因作物，油菜种植面积占1 010万hm2[8]。试验选择检测对象时，也正是考虑到了当前泸定县涉及种植面积较大的经济作物，所以选择了油菜作为检测分析对象。试验结果表明，泸定区域内所售卖或种植的油菜未检测到P-FMV 35S、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S、T-E9 3′等外源转基因成分，说明相关职能部门做的宣传监督工作到位以及种植者合法种植。但由于研究采取随机抽样获得油菜样品，测试样品中未检测到相关外源转基因成分，这并不能说明该区域内售卖或种植的油菜中不含这些外源基因的油菜品种。因此仍需相关职能部门加强监管，重视农产品的来源，定期对市场中的农产品进行抽检，为消费者提供消费选择，保护消费者的合法权益。