注射氨基酮戊酸光动力疗法对大鼠痤疮样炎性结节模型的疗效及组织病理学影响

赵菊花 庄化迪 刘顺英 曾润鑫 宋锦渲

1南充市中心医院皮肤科 川北医学院第二临床医学院，四川637000；2西南医科大学研究生院，四川泸州646000；3川北医学院临床医学院，四川南充637000

中重度痤疮的皮疹以结节、囊肿为主，属难治性痤疮类型，严重者可留有凹陷性或者增生性瘢痕。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）治疗中重度痤疮效果良好，目前临床上常规方法是外敷盐酸氨基酮戊酸（ALA）溶液后照光，但结节、囊肿等病灶可能因囊肿壁较厚、吸收光敏剂较少致疗效欠佳［1］。国外学者［2］将ALA 局部注射到痤疮患者皮损内进行光动力治疗，发现早期改善效果较好，可以减少总治疗次数，且不良反应少。目前国内ALA只有外用剂型，直接注射ALA 入痤疮皮损内的有效性和安全性未见报道。我们配制5%ALA 溶液皮下注射入大鼠耳廓痤疮样炎症结节模型后采用PDT治疗，观察大鼠耳廓的组织病理改变。

一、材料与方法

1.实验动物：40只SPF级、6 ～8周龄、体重（180±20）g健康SD 大鼠，雌雄各半。由川北医学院动物中心提供动物、清洁级动物饲养房（温度25 ℃，湿度50%～60%）和SPF级动物实验室。实验动物合格证号为SCXK（川）2018⁃18，实验动物使用许可证号为SYXK（川）2018⁃076。

2.主要试剂及仪器：ALA（上海复旦张江生物医药股份有限公司）保存于4 ℃冰箱，实验当天在避光条件下于118 mg ALA 加入2 ml 灭菌注射用水配成5%ALA 溶液备用。LED⁃1B 型红光治疗仪［波长（633±10）nm，武汉亚格光电技术股份有限公司］、痤疮丙酸杆菌标准株（ATCC6919，广东微生物研究所）。

3.大鼠分组与造模：将大鼠按体重编号，按照随机数字表将40只大鼠分为正常对照组（10只）、造模组（30只）。将保存于-80 ℃冰箱的痤疮丙酸杆菌标准株在室温下复温，接种于布鲁氏琼脂平板，放入厌氧产气袋，置于37 ℃CO2培养箱中培养72 h，采用麦氏比浊法计数，用灭菌注射用水调至浓度3×108菌落形成单位/ml，参照文献［3］和预实验结果，在造模组每只大鼠右侧内耳廓中央皮内注射痤疮丙酸杆菌液100 μl，隔天同一部位注射1 次，共3 次，最后1 次菌液注射后第7 天肉眼观察并触摸到大鼠耳部均有结节，随机抽取1只大鼠，用无菌针头挑取鼠耳廓肿胀部位，接种于布鲁氏琼脂培养皿，厌氧罐中培养48 h，证明为痤疮丙酸杆菌，表明建成大鼠耳痤疮样炎性结节模型。造模成功后按照随机数字表法将造模组分为3 组，即模型对照组、外敷ALA组、注射ALA组，每组10只。

4. 治疗方案：正常对照组大鼠正常饲养，不做任何治疗。模型对照组造模成功后继续饲养，不予后续治疗。外敷ALA 组采用50 μl 5%ALA 浸湿纱布外敷在皮损处，塑料薄膜封包，避光2 h后照红光。注射ALA组在耳廓结节处皮下多点注射50 μl 5%ALA溶液，避光2 h后照红光。照光距离10 cm，能量密度80 mW/cm2，波长633 nm，时间10 min。每周治疗1 次，共2 次。末次治疗24 h 后麻醉大鼠，取心脏血，并剪取鼠耳组织检测相关指标。

5.疗效观察：末次治疗24 h 后肉眼观察各组大鼠耳廓红肿、结节大小、皮损表面情况等。于大鼠右耳耳廓同一部位测量各组大鼠耳廓厚度。

6. 组织病理检查：剪取鼠耳组织以4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察各组组织病理变化。

7.安全性指标检测：取各组大鼠心脏血，检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）。

8. 统计学方法：采用SPSS19.0 统计软件，计量资料以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用LSD⁃t 检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

二、结果

1.大鼠耳廓厚度比较：实验结束时，正常对照组、模型对照组、外敷ALA 组、注射ALA 组大鼠耳廓厚度分别为（0.435±0.006）、（1.269±0.071）、（1.088±0.098）、（0.699±0.095）mm，差异有统计学意义（F = 235.60，P < 0.001），模型对照组高于正常对照组、外敷ALA 组和注射ALA 组（t值分别为24.18、5.24、16.48，均P<0.01）；注射ALA 组低于外敷ALA组（t=11.24，P<0.01）。

2.大鼠耳部皮肤大体观察（图1）：实验结束时，正常对照组大鼠右耳廓皮肤无变化；模型对照组自造模完成后，注射局部皮肤持续红肿，至实验结束时该红肿仍持续存在，并在该部位可触摸到明显的结节，质较硬；外敷ALA组局部仍有轻度的红肿，5只大鼠右侧耳廓仍可触摸到结节，但红肿和结节较模型组软和小；注射ALA 组3 只大鼠右侧耳廓在第1 次注射ALA 的第2 天可见结痂，经外用聚维酮碘处理后，3 ～4 d脱落，实验结束时7只大鼠右侧耳廓红肿消退，未触摸到明显的结节，皮肤表面正常，但3只大鼠右侧耳廓皮肤表面于治疗处可见轻度瘢痕形成。

3.大鼠耳廓皮肤组织病理（图2）：实验结束时，正常对照组大鼠耳廓表皮、真皮、皮脂腺、软骨、肌肉均未见明显病变。模型对照组表皮大致正常，真皮深层及皮下组织结构消失，其内可见大量炎症细胞弥漫性浸润，8只形成脓肿和炎症细胞聚集成结节状，3只耳软骨结构被局限性破坏，皮脂腺数量较少、体积较小。外敷ALA组表皮大致正常，毛囊皮脂腺缩小，真皮及皮下组织可见炎症细胞浸润，5只形成小的微脓肿。注射ALA 组大鼠耳廓表皮正常，真皮及皮下组织内浸润的炎症细胞较模型组和外敷ALA 组明显减少，可见较多的胶原纤维和血管扩张、充血。

4. 大鼠肝肾功能比较：实验结束时，各组大鼠ALT、AST、Cre、BUN差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表1。

三、讨论

中重度痤疮既往多采用维A酸制剂联合局部外用或系统口服抗生素治疗，但因不良反应多，临床应用受到限制［4］。目前外敷ALA⁃PDT是治疗中重度痤疮行之有效的方法之一［5］。但以结节、囊肿为主要表现的中重度痤疮，皮损浸润较深，还常伴严重增厚的囊壁，故常规直接外敷光敏剂ALA 很难被吸收，使PDT 疗效不佳［1］。有学者曾用粉刺针清［4］、火针、激光［6］、微针等预处理皮损后形成孔道以增加ALA吸收。有学者［2］将ALA局部注射到痤疮患者皮损内再行PDT，但大多是一些小样本的研究，且其疗效不一。

本研究参照文献［7］，以大鼠作为模型动物，经痤疮丙酸杆菌皮内注射大鼠耳廓内侧面造模后，出现了耳廓红斑、肿胀、结节等表现，且皮损培养证明是痤疮丙酸杆菌感染。造模后模型组大鼠耳廓红肿，可触及结节，且其耳廓厚度明显大于正常对照组，证明成功制备大鼠耳廓痤疮样炎性结节模型。实验结果显示，外敷ALA组和注射ALA组与模型对照组比较，大鼠耳廓的肿胀程度和耳廓厚度均显著降低，提示外敷或注射ALA⁃PDT 均能抑制痤疮丙酸杆菌导致的大鼠耳廓肿胀。与外敷ALA组比较，注射ALA组大鼠耳廓厚度减少更明显，提示注射ALA 到皮损内再照光的光动力治疗较直接外敷ALA治疗更有效。各组大鼠耳廓外观和组织病理切片观察结果显示，在实验结束时，模型对照组局部红肿，仍可触摸到明显的结节，质较硬；表皮大致正常，真皮深层及皮下组织结构消失，其内可见大量炎症细胞弥漫性浸润，部分形成脓肿，炎症细胞聚集成结节状，皮脂腺数量较正常对照组少且体积较小。外敷ALA组局部仍有轻度的红肿，部分大鼠右侧耳廓仍可触摸到结节，但红肿较模型组轻，结节较模型组小；表皮大致正常，毛囊皮脂腺缩小，真皮及皮下组织可见较多炎症细胞浸润，部分形成小的微脓肿，但炎症细胞数量较模型对照组少。注射ALA组7只大鼠耳廓红肿消退，未触摸到明显的结节，皮肤表面正常；耳廓表皮正常，真皮及皮下组织内浸润的炎症细胞较模型组和外敷ALA 组明显减少，未见团块状分布的炎症细胞或者微脓肿形成，可见较多的胶原纤维和扩张的血管、充血。上述大体和组织病理学检查结果提示，注射ALA⁃PDT 可治疗大鼠痤疮样炎性结节模型的结节，明显减轻痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应，且较外敷ALA⁃PDT的疗效更好。

表1 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对大鼠肝肾功能的影响（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法对大鼠肝肾功能的影响（±s）

注：n=10

组别正常对照组模型对照组外敷ALA组注射ALA组F值P值天冬氨酸转氨酶（U/L）105.2±17.5 109.5±20.5 102.7±18.1 100.2±18.3 0.45 0.71丙氨酸转氨酶（U/L）28.8±5.0 31.2±7.6 30.3±7.8 31.1±6.8 0.25 0.85尿素氮（μmol/L）32.0±6.5 34.0±7.8 32.3±7.1 30.3±7.3 0.43 0.73肌酐（μmol/L）5.9±0.6 6.3±0.7 6.2±0.7 6.4±0.9 1.02 0.39

图1 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法治疗后各组大鼠耳廓皮肤大体观 1A：正常对照组皮肤无变化；1B：模型对照组皮肤红肿，可触及结节；1C：外敷ALA组可见轻度红肿，仍可触及结节；1D：注射ALA治疗组红肿和结节基本消退

图2 氨基酮戊酸（ALA）光动力疗法治疗后各组大鼠耳部皮肤组织病理变化（HE×100） 2A：正常对照组表皮真皮结构正常；2B：模型对照组真皮内大量炎症细胞浸润，形成团块状结节；2C：外敷ALA组真皮内仍有较多炎症细胞浸润、微脓肿；2D：注射ALA组真皮内炎症细胞较少

注射ALA 组3 只大鼠耳廓可见轻度瘢痕形成，而有文献报道外敷ALA⁃PDT 可治疗兔耳增生性瘢痕模型［8］，故我们认为，注射ALA⁃PDT 治疗后小部分大鼠耳廓注射部位有结痂，可能是注射手法、深浅未控制好，或是因为注射ALA后照光，局部光化学反应过强而在愈合后形成瘢痕，这有待在今后的研究中扩大样本进行观察。肝肾功检测结果显示，注射ALA组、外敷ALA组与正常对照组比较，各指标均无统计学差异，提示注射ALA⁃PDT 安全，并未增加不良反应。

综上所述，本研究显示，注射ALA⁃PDT 治疗大鼠痤疮样炎性结节模型较外敷ALA⁃PDT 能显著提高疗效，减少炎性结节和炎症细胞数，且未见肝肾功能损害，提示注射ALA⁃PDT 治疗中重度痤疮有效且安全，但能否应用于痤疮患者，以及有无远期不良反应，还需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突