地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响△

崔铮 靖鹏举 朱冬梅 王媛

多种眼科疾病与视网膜炎症相关，如葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变及年龄相关性黄斑变性等[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通过激活白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)炎症信号通路等导致炎症因子释放，诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞产生炎症反应，炎症反应可引起多种化学介质、细胞因子等分泌，导致视力不同程度损伤[4-6]。地塞米松(dexamethasone，Dex)是一种人工合成的皮质类固醇，可有效减轻和防止组织炎症反应，减轻炎症表现。有研究报道，Dex可减轻LPS内毒素诱导的小鼠葡萄膜炎症反应[7-8]，但关于Dex对LPS诱导RPE细胞炎症反应的作用鲜见报道。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)属于NOD样受体家族中一种重要炎性小体，可通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)，在固有免疫及疾病发生发展中发挥重要作用，与系统性红斑狼疮等多种疾病有关[9-11]。因此，本研究拟探究Dex对LPS诱导RPE细胞ARPE-19炎症损伤的作用，及其对NLRP3/Caspase-1通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料ARPE-19细胞(货号：CC-Y1051)购自ATCC细胞库； Dex(HPLC≥98%，货号：D8040-100 mg)、LPS(货号：L8880)均购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM/F-12 培养基(货号：12634010)、胎牛血清(货号：10099141)均购自美国Gibco公司；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(货号：6210A)、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(货号：638314)、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(货号：RR820A)均购自大连宝生物科技有限公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；蛋白抽提试剂盒(批号：P0028)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)均购自上海碧云天有限公司；MTT试剂盒(货号：V13154)、人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α) ELISA试剂盒(货号：BMS223HS)、人IL-1β试剂盒(货号：BMS213HS)、人IL-6 ELISA试剂盒(货号：BMS213HS)、兔源NLRP3抗体(货号：PA5-20838)、Caspase-1(货号：MA5-32137)、GAPDH抗体(货号：TAB1001)、羊抗兔IgG(货号：A32731)均购自美国Invitrogen公司。MODEL550型酶标仪、7300 RT-qPCR仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养常规复苏ARPE-19细胞后，于含体积分数10%胎牛血清、10 g·L-1青-链霉素的DMEM/F12培养基中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养，每2 d更换培养基，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT检测及实验分组将对数期生长ARPE-19细胞消化计数后以每孔5000个接种于96孔板，每孔添加100 μL培养基，待细胞融合至85%～90%时更换为无血清培养基孵育24 h，随机分组：无任何处理的ARPE-19细胞为正常对照(normal control，NC)组；5 mg·L-1LPS刺激24 h的ARPE-19细胞为LPS组；0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1、0.40 mol·L-1、0.80 mol·L-1Dex分别预处理2 h后，5 mg·L-1LPS刺激24 h的ARPE-19细胞为不同浓度Dex+LPS组。各组均继续培养24 h、48 h、72 h后，采用MTT试剂盒检测细胞存活率，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。细胞存活率=(D处理组/D空白组)×100%。

筛选出Dex的最佳作用浓度和时间后，确定最终分组：NC组、Dex组(0.20 mol·L-1Dex处理 ARPE-19细胞24 h)、LPS组、Dex+ LPS组(0.20 mol·L-1Dex预处理2 h后，5 mg·L-1LPS处理ARPE-19细胞24 h)。取对数期生长ARPE-19细胞消化计数后，以每孔5×106个接种于6孔细胞板，分组处理后收集细胞进行后续检测。

1.2.3 RT-PCR检测收集各组细胞，添加Trizol试剂提取总RNA，纯度及浓度检测合格后反转录合成cDNA，采用RT-qPCR试剂盒说明进行TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA扩增，GAPDH为内参，引物序列见表1。每个样品设置3个复孔。反应条件设置：95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s;40个循环,添加溶解曲线。TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 ELLSA检测TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平ELLSA法检测各组ARPE-19细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白水平提取各组ARPE-19细胞总蛋白，BCA试剂盒检测562 nm处样品蛋白含量。取60 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，恒压转膜，50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭120 min，PBST冲洗3次，每次20 min，分别添加一抗NLRP3抗体(11000)、Caspase-1抗体(11000)、GAPDH抗体 (1500)，4 ℃孵育过夜，PBST 缓冲液洗3次，每次 20 min，用适量含20 g·L-1脱脂奶粉的PBS稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(15000)室温孵育1 h后，洗膜，显色，曝片拍照，应用Image J图像分析软件分析各蛋白条带灰度值，以靶蛋白条带与GAPDH蛋白条带比值为靶蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理采用 SPSS 20.0软件进行统计分析。TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白水平均以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA 检验)，组内两两比较采用SNK-q检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 Dex、LPS对ARPE-19细胞活性的影响同一时间点，与NC组比较，LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低(均为P<0.05)；与LPS组比较，不同浓度Dex+LPS组ARPE-19细胞存活率均显著增加(均为P<0.05)。同一作用时间，随着Dex浓度增加，细胞存活率呈先升高后下降的趋势；同一处理浓度，24 h、48 h、72 h细胞活性差异无统计学意义(均为P>0.05)。其中0.20 mol·L-1Dex作用LPS诱导ARPE-19细胞24 h、48 h时细胞存活率均接近NC组，综合考虑后选用0.20 mol·L-1Dex作用24 h用于后续实验(见表2)。

表2 各组ARPE-19细胞存活率

2.2 Dex对LPS诱导的ARPE-19细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平的影响NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与NC组、Dex组比较，LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均显著升高，且Dex+LPS组各炎症因子mRNA相对表达量均显著低于LPS组(均为P<0.05)(见表3)。

表3 各组ARPE-19细胞各炎症因子mRNA相对表达量

2.3 Dex对LPS诱导的ARPE-19细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表达水平的影响NC组与Dex组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与NC组、Dex组比较，LSP组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表达水平均显著升高，且Dex+LPS组各蛋白表达水平均显著低于LPS组(均为P<0.05)(见表4)。

表4 各组ARPE-19细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平

2.4 Dex对LPS诱导的ARPE-19细胞中NLRP3/Caspase-1通路的影响NC组与Dex组NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与NC组、Dex组比较，LPS组、Dex+LPS组NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高，且Dex+LPS组NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白水平均显著低于LPS组(均为P<0.05)(见图1、表5)。

图1 Western blot检测各组ARPE-19 细胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平

表5 各组ARPE-19 细胞中NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表达水平

3 讨论

RPE细胞在视觉形成及维持过程中起非常关键的作用，而炎症反应可导致RPE细胞炎症损伤，与多种眼科疾病发病机制有关，可引起不同程度视力受损[12-14]。本研究采用LPS诱导ARPE-19细胞发现，与正常ARPE-19细胞比较，LPS组ARPE-19细胞存活率降低，细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表达水平升高。TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，在病理状态下水平上升，有抗感染、抗炎性介质作用；而IL-1β、IL-6均为重要促炎因子，提示LPS诱导ARPE-19细胞炎症损伤成功。本研究还发现，与LPS组比较，Dex+LPS组ARPE-19细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表达水平均显著降低。Dex是一种糖皮质激素，可抑制炎症细胞聚集、炎症介质合成和释放等，有效减轻炎症反应[15-16]。张治成等[17]报道，鼻窦内窥镜术后盐酸氨溴索联合Dex雾化治疗可显著降低患者血清IL-5、IL-12水平，缓解鼻窦炎临床症状、促进鼻腔黏膜功能恢复。Yu等[8]报道，Dex可通过下调IL-6、TNF-α表达减轻LPS诱导性小鼠葡萄膜炎前房炎症，对小鼠葡萄膜炎有保护作用。综合以上研究及本研究结果，我们认为，Dex可减轻ARPE-19细胞炎症反应，可能与下调TNF-α、IL-1β、IL-6因子的表达有关。

NLRP3在单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中大量表达，可通过LRR结构域与其配体结合，募集凋亡相关斑点样蛋白(ACS)、Caspase形成复杂炎性小体，产生活化的Caspase-1(又称IL-1β转化酶)，进而将IL-Iβ前体裂解为成熟IL-1β分泌到细胞外发挥作用。NLRP3还可激活NF-κB信号通路，引起IL-1、TNF-α、IL-8等大量促炎因子产生级联放大效应[18-19]。Qu等[20]报道，肉桂醛可通过抑制DSS诱导的结肠炎细胞RAW264.7中NLRP3炎症小体表达，进而抑制细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6活性，减轻溃疡性结肠炎炎症反应。Bian等[21]报道，Dex处理单侧角膜中央碱烧伤大鼠，可下调NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表达水平,抑制NLRP3炎症小体通路，促进角膜碱烧伤创面愈合。本研究结果显示，与LPS组比较，Dex+LPS组ARPE-19细胞中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低，提示Dex可能通过下调NLRP3、Caspase-1的表达抑制NLRP3/Caspase-1通路。

综上所述，Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路下调炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，减轻LPS诱导的ARPE-19细胞炎症损伤作用。但Dex抑制ARPE-19细胞炎症损伤的具体作用机制及是否还存在其他通路共同作用尚不完全清楚，有待后期进一步深入探究。本研究结果可能为视网膜炎症相关性眼科疾病的防治提供一定参考。