曙红Y与乳酸环丙沙星相互作用的分光光度法研究及应用

李华岑 朱雷 李娜 邱富娜/河南省兽药饲料监察所 450008

乳酸环丙沙星(CFLX)适用于敏感细菌及支原体所致畜禽及小动物的各种感染性疾病。主要用于鸡的慢性呼吸道病、大肠杆菌病、传染性鼻炎、禽巴氏杆菌病、禽伤寒、葡萄球菌病，仔猪黄痢、仔猪白痢等。目前对乳酸环丙沙星的检测方法主要有滴定法和高效液相色谱法。本文进行了曙红Y(EY)与乳酸环丙沙星相互作用的分光光度法研究，建立了曙红Y测定乳酸环丙沙星的新方法，用于乳酸环丙沙星可溶性粉中乳酸环丙沙星含量的测定，结果满意。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂PE公司lamda35型双光束紫外光谱仪；BT 224S分析天平（Sartorius公司）；乳酸环丙沙星(中国兽医药品监察所，批号H0141706，含量99.5%)：65.2mg·L-1；5.0×10-4mol·L-1曙红Y溶液；0.01%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液；0.1%十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）；0.1%十二烷基苯磺酸钠（SDBS）；乳酸环丙沙星可溶性粉（河南健达兽药有限公司，批号为JD190714，规格：按环丙沙星计10%）；所用水为纯化水；其它试剂为分析纯。

1.2 实验方法在10mL容量瓶中依次加入1.00mL曙红Y溶液、适量乳酸环丙沙星标准溶液或待测液、1.0mL 0.01% PVP溶液，加0.1mol/L盐酸0.6mL，用水稀释至刻度，摇匀，以水为参比立即进行光谱扫描或固定波长为536nm进行吸光度测定。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱以水为空白，对体系进行光谱扫描，结果见图1。由图1可知，乳酸环丙沙星(13mg·L-1)最大吸收峰在277nm，曙红B(5.0×10-5mol.L-1)可见区最大吸收峰在516nm，加入乳酸环丙沙星后体系在可见区的最大吸收红移到536nm，红移20nm，且吸光度明显增加。说明体系中应该有乳酸环丙沙星与曙红Y的复合物生成。

图1 吸收光谱

2.2 酸度对体系的影响在10mL容量瓶中，依次加入1.00mL曙红Y溶液、3.0mL乳酸环丙沙星标准溶液，分别用1、0.1、0.01、0.001mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，以水为参比立即进行光谱扫描，结果发现用0.01mol/L盐酸稀释后体系最大吸收波长红移最大。随后考察了0.1mol/L盐酸加入体积的影响，结果发现体系中加入0.4～0.8mL 0.1mol/L盐酸时，最大吸收波长红移波长最大、红移波长数稳定、在536nm波长处体系和曙红Y吸光度的差值最大，选择0.1mol/L盐酸加入量为0.6mL。

2.3 体系吸光度的稳定性体系的吸光度随时间减小，10min后溶液变浑浊并慢慢产出沉淀，为了提高体系的稳定性考察了非离子表面活性剂对吸光度的影响，结果发现加入0.01% PVP 1.0mL后体系不再发生浑浊、吸光度非常缓慢的变小，1h内体系吸光度仅减小3%。为提高测定准确性，选择体系混匀后立即测定。

2.4 最大结合数的测定固定乳酸环丙沙星浓度为1.55×10-5mol.L-1，改变曙红Y的浓度，以相应的试剂空白为参比测定体系的吸光度。以吸光度为纵坐标，以n(cEY/cCFLX)为横坐标作图，结果见图2。由图可知，n=1时出现一明显折点。依据摩尔比法原理，乳酸环丙沙星与曙红Y的最大结合数为1。

图2 摩尔比法

图3 吸收光谱图

2.5 离子强度的影响实验用NaCl溶液考察了离子强度对体系的影响。发现，体系中加入NaCl后，体系中NaCl浓度为0.02～0.1mol.L-1时，吸光度随NaCl浓度增大而缓慢变小。吸光度变小，表明乳酸环丙沙星与曙红Y可能主要通过静电引力结合。

2.6 表面活性剂的影响及反应机理探讨加入0.01% PVP 1.0mL，体系吸光度有一定的增大。加入阴离子表面活性剂0.1% SDBS 1.0mL，体系的吸光度几乎完全猝灭。加入阳离子表面活性剂0.1% CTMAB 0.05mL，体系的吸光度显著增大。

非离子表面活性剂PVP的存在可能会聚集体系中CFLX与EY的复合物，形成胶束增敏体系使体系的吸光度增大。

对EY中加入CFLX和CTMAB的体系进行光谱扫描，结果见图3。由图可知，CFLX(13mg·L-1)与CTMAB(5mg·L-1)的加入均能使EY(5.0×10-5mol.L-1)的最大吸收波长发生红移，推测CFLX、CTMAB与EY的结合方式是相似的。CTMAB与EY的结合可能主要是CTMAB分子中的季铵N＋正电荷与EY分子中的羧酸基－COO－负电荷间的作用。CFLX分子中有仲胺和叔胺，在酸性条件下，容易形成季铵N＋正电荷，可以和EY分子中的羧酸基－COO－负电荷结合生成离子复合物(CFLX和EY分子结构图见图4)。

图4 乳酸环丙沙星与曙红Y的分子结构图

体系中加入不同浓度SDBS的吸收光谱见图5，由图可知：随着SDBS浓度的增大，体系最大吸收波长由533nm变为513nm。大量SDBS(100mg·L-1)的存在会抑制EY与CFLX复合物的形成，因为静电引力是一种非定向性的作用力，在大量SDBS阴离子的存在下，CFLX大部分可能会与SDBS结合，生成CFLX与SDBS的复合物，从而抑制CFLX与EY复合物的生成，而CFLX与SDBS的复合物在536nm没有吸收或有很弱的吸收，从而使体系的吸光度产生严重猝灭。

图5 吸收光谱图

因而，推测乳酸环丙沙星与曙红Y主要通过静电引力结合，形成结合比为1:1的离子复合物。

2.7 线性范围、检出限和精密度乳酸环丙沙星在1.3～19.6mg·L-1浓度范围内服从比尔定律；回归方程为：A=0.0204c(mg·L-1)+0.3213，相关系数为0.9958。按cL=3S/K得方法检出限为0.3mg·L-1。对浓度为13mg·L-1的乳酸环丙沙星标准溶液进行平行测定求得相对标准偏差RSD＝1.0%(n=6)。

2.8 样品测定

精密称取样品乳酸环丙沙星可溶性粉约0.25g，置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。取适量供试品溶液按实验方法对样品进行分析，结果见表1。

表1 乳酸环丙沙星可溶性粉的测定和回收(n=6)