华蟾素对非小细胞肺癌细胞株A549细胞增殖及PTEN/AKT/mTOR信号通路表达的影响

张生义，张己为，张旭峰，张 逸，许斌斌，左顺庆

近年来，我国的癌症发病率和死亡率不断在增加，癌症已成为我国居民的主要死亡原因，肺癌的发病率和死亡率居各类恶性肿瘤之首，其恶性程度高、进展快[1]。目前临床上针对肺癌的治疗手段主要以手术、化疗及放疗为主，但大部分肺癌病人确诊时已是晚期，失去了手术的最佳时机，而传统化疗方案疗效有限，亦存在耐药现象，放疗不良反应较大。因此需探索新的肺癌治疗方式。近年来随着中药提纯技术的提高，应用中药及其有效成分进行综合治疗已成为肿瘤领域的研究热点。华蟾素为干蟾皮经科学方法提取加工制成的水化萃取物，具有清热解毒、利水消肿等作用，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，其抗肿瘤的机制尚未完全明确。本研究以肺癌细胞株A549为研究对象，探讨华蟾素抗肺癌的分子机制。现作报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，5毫升/支，批号041003)。兔抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)(#4060)、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)(#4228)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)(#4292)、兔抗蛋白激酶B(AKT)(#4691)、兔抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)(#2974)、兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(#2972)、兔抗p-S6(#4858)、兔抗S6(#2217)、兔抗磷酸化PTEN(p-PTEN)(#9551)、兔抗PTEN(#9188)、兔抗肌动蛋白(β-actin)(#8457)抗体均购自Cell Signaling Technology公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(EMD Millipore公司，#C2035)。人非小细胞肺癌细胞株A549细胞株(中科院上海生命科学研究院细胞资源中心)。DMEM 细胞培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、100 μg/mL青霉素+链霉素均购自美国Invitrogen公司。EdU(Sigma公司)，细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒(碧云天公司)。单人超净台(北京六一仪器厂)；HD-3000 凝胶成像仪(上海上天精密仪器有限公司)；CB15 CO2细胞培养箱(北京六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人非小细胞肺癌细胞株A549常规复苏，用含10%胎牛血清的DMEM培养液、青霉素(100 μg/mL)及链霉素(100 μg/mL)的培养液进行培养，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中。取对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用细胞计数仪行细胞计数。

1.2.2 CCK8检测细胞增殖 取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化离心后，0.5×104个/孔的密度种植于96孔板中。培养24 h待细胞贴壁后弃去培养液，处理组加入0.2、0.8 μg/mL华蟾素注射液；空白对照组加入等量DMEM培养液。使用CCK-8检测不同浓度华蟾素、不同处理时间(6、12、24、48、72 h)的A549细胞增殖活力。于时间点每孔加入10 μL CCK8试剂并置于37 ℃孵育4 h，用酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度值。计算均数及标准差，运用GraphPad软件绘制时间依赖生长曲线。

1.2.3 免疫荧光染色 将对数生长期的细胞分为对照组、阴性对照组、实验组，调整细密度为1×105/mL，接种于有无菌盖玻片的24孔板中，37 ℃，5% CO2条件下，培养72 h，根据EdU染色试剂盒说明书，检测细胞增殖。完全培养基稀释EdU溶液为10 mmol/mL，每孔加入100 μL，孵育4 h后弃培养基，PBS清洗2次，多聚甲醛固定24 h，TBST+驴血清破膜30 min，一抗Ki67过夜孵育，PBST清洗3次，每次10 min，二抗荧光显色剂Alexa-488+Apollo+DAPI染色试剂孵育1 h，PBST清洗3次，每次10 min，封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4 免疫印迹法检测蛋白表达 胰酶消化并收集华蟾素处理(对照组为等量DMEM培养液)后72 h的A549细胞，弃培养液，用预冷的PBS清洗2次，加入预冷的含有蛋白酶抑制剂(含1% PMSF、1%氟化钠、1%钒酸钠)的细胞裂解液RIPA，冰浴5～10 min后刮取细胞至离心管，冰上超声裂解2 min，12 000 ×g离心后取上清细胞裂解液裂解细胞，分光光度计测定蛋白浓度，取总蛋白样品进行10% SDS-PAGE电泳并湿转印至PVDF膜上。含5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，4 ℃一抗(抗体浓度：p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-S6、S6、p-PTEN、PTEN、β-actin均为1∶1 000)孵育过夜。次日TBST洗膜3次(每次8 min)后，用山羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST洗膜3次(每次8 min)，ECL化学发光显色，Tanon 4500自动化学发光图像分析系统扫描并采用Quantity One软件进行图像灰度分析，计算灰度比值，运用GraphPad软件进行结果绘图。

1.3 统计学方法 采用方差分析和Dunnett-t检验。

2 结果

2.1 华蟾素抑制肺癌细胞A549增殖 CCK8法检测结果示，与对照组比较，0.2 μg/mL华蟾素作用A549细胞株48 h后显示明显抑制作用(P<0.01)，0.8 μg/mL华蟾素处理12 h后均具有不同程度抑制作用(P<0.05～P<0.01)(见表1)。进一步应用EdU及Ki67免疫荧光法检测检测华蟾素对A549细胞株增殖的影响(见图1)，结果显示，与对照组比较，0.2、0.8 μg/mL华蟾素作用72 h后，A549细胞增殖均受到抑制(P<0.05～P<0.01)(见表2)。

表1 CCK8法检测对照组和华蟾素处理组不同时间点细胞增殖情况

表2 Ki67、EdU检测对照组和华蟾素处理组细胞增殖情况

2.2 华蟾素下调PTEN/AKT/mTOR通路活性 0.2、0.8 μg/mL华蟾素作用于细胞72 h后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6、p-PTEN表达量均较对照组下降(P<0.05～P<0.01)，而PI3K、AKT、mTOR、S6及PTEN表达量与对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见图2、表3)。

续表2

表3 对照组和华蟾素处理组AKT/mTOR信号通路蛋白表达量比较

3 讨论

华蟾素是中华大蟾蜍的干燥表皮的水化萃取物，其主要成分是吲哚生物碱类、嘧啶类以及生物碱等，具有清热解毒、消炎、强心、利水消肿、抗病毒、止痛等作用[2]。华蟾素还具有抗癌功效,可明显抑制肺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌细胞的生长[3-4]。本研究结果表明华蟾素可以以时间及剂量依赖方式抑制肺癌A549细胞增殖，与既往研究[5-6]结果一致。

在肿瘤组织中，肿瘤信号转导蛋白磷酸化水平往往表达异常，这与癌细胞增殖、迁移和侵袭性明显相关[7]。PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白磷酸化表达增强可影响肿瘤细胞的增殖能力，抑制凋亡发生[8]。PTEN是PI3K/AKT传导通路的负性调控因子，其可去磷酸化PIP3，产生PIP2，从而终止PI3K介导的信号转导[9]。在本研究中，华蟾素可以明显的降低A549细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6的表达量，而对PI3K、AKT、mTOR、S6的表达量没有明显影响。这说明华蟾素可能是通过抑制肿瘤信号转导蛋白磷酸化而抑制A549增殖。既往研究[10]发现在癌组织中，PTEN主要通过基因突变、杂合性丢失、甲基化等方式失活而造成表达量异常。此外，研究[11-12]表明PTEN的翻译后修饰还包括磷酸化、氧化、和蛋白结合等，其中以磷酸化最为重要。在本研究中，华蟾素明显降低p-PTEN的表达量，这进一步说明华蟾素可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路上游信号蛋白PTEN的磷酸化，进而进一步抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白磷酸化而发挥抑制肿瘤的作用。

综上，华蟾素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白磷酸化，抑制肺癌细胞A549的增殖。