枝顶孢霉属内生真菌CEF-193 对棉花黄萎病的控制作用

张向月，赵丽红，冯鸿杰，魏锋，张亚林，朱荷琴，冯自力

（棉花生物学国家重点实验室/ 中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455000）

中国每年有超过13 万hm2的棉花被黄萎病侵害[1-2]。 棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起，通过侵染棉花根部，导致棉花植株逐渐死亡，严重威胁棉花的产量和纤维品质。 大丽轮枝菌宿主十分广泛，以对环境胁迫具有很强抵抗力的微菌核形态度过休眠期， 在土壤中存活多年，且可以在棉花的各个生长阶段进行侵染，因此很难防控[3-8]。在农业生产中，由于难以实施轮作，田间棉花连作往往导致土壤中病原数量过多，极易发生病害，而目前仍缺乏对大丽轮枝菌抗性优良的棉花品种和强效杀菌剂，生物防治因其无污染、易开发等优点，成为防控黄萎病的重要手段[9-10]。

许多研究表明植物内生真菌具有促进宿主植物生长、增强植物的抗病害能力等作用。 2014 年，Li 等[11]在棉花上分离并筛选出了7 株内生真菌，其中菌株CEF-193 对棉花黄萎病菌具有较高抑菌活性。 为进一步明确该菌株对棉花黄萎病的防治效果， 本课题组于2016―2017 年在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室和试验地开展了相关研究，现将结果报道如下，以期为黄萎病的有效控制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试棉花品种为鲁棉研21， 为黄河流域棉区主栽品种， 供试菌株为大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080，均由中国农业科学院棉花研究所棉花病害课题组提供。CEF-193 发酵液和固体菌剂按下述方式制备。

CEF-193 发酵液：在发酵罐中加入察氏培养基灭菌后，再加入CEF-193 的分生孢子悬浮液（孢子含量为1×107mL－1，体积为培养基的5%），于25 ℃下发酵培养3 d 获得发酵原液。 将制备好的发酵原液稀释至孢子含量1×107mL－1即为试验用发酵液。

固体菌剂： 装有质量比为1∶1 的玉米和蛭石的克氏瓶经灭菌后， 接种5 mL CEF-193 的分生孢子悬浮液（孢子含量为1×107mL－1），25 ℃暗培养7 d 后取出培养物，自然风干制成固体菌剂。

1.2 菌株CEF-193 对棉花黄萎病的温室防治效果测定

棉花种植： 在温室中种植鲁棉研21 棉花种子于盆中，以每盆8 粒种子的密度种植，每6 个盆栽作为1 个处理。 待棉花幼苗第一片真叶初现时，进行试验处理。

发酵液喷雾： 将CEF-193 发酵液均匀喷施在棉花幼苗上，直至叶片完全湿润，对照用清水喷施，每个处理3 次重复。 处理后第4 天时，每盆通过灌根接种孢子含量1×107mL－1的Vd080 分生孢子悬浮液50 mL。

发酵液灌根： 每盆棉花用CEF-193 发酵液50 mL 灌根，以清水作为对照，每个处理3 次重复。 处理后第4 天时均按上面方法接种Vd080 分生孢子悬浮液。

固体菌剂混土： 将固体菌剂按质量分数1%与蛭石沙土基质均匀混合， 装入盆中种植鲁棉研21的种子， 待第一片真叶初现时按上面方法接种Vd080 分生孢子悬浮液。以蛭石沙土基质混合无菌培养物的盆栽作为对照，每个处理3 次重复。

发病调查： 上述3 种处理均在接菌25 d 后参照5 级分级标准进行病害调查[12]。 病情分级标准：0级，叶片发病面积占比为0；1 级，0＜叶片发病面积占比≤33%；2 级，33%＜叶片发病面积占比≤66%；3 级：66%＜叶片发病面积占比＜100%；4 级：叶片发病面积占比为100%。

1.3 菌株CEF-193 对棉花黄萎病的大田防治效果测定

大田棉花种植：2017 年4 月下旬在中国农业科学院棉花研究所连年严重发生黄萎病的棉花试验田中种植鲁棉研21 号， 种植密度为5 万株·hm－2。 根据试验处理设置小区， 随机排列，3 次重复，每个小区4 行，行长8 m，行距0.8 m。

发酵液喷雾：于6 月初，将制备好的CEF-193 发酵液稀释8 倍，喷施在棉苗上，每小区用量8 L。

发酵液灌根：待棉花出苗后，在棉花根部灌根CEF-193 发酵液， 每小区用量4 L。 之后每隔15 d灌根1 次，共4 次，对照灌根等量清水。

固体菌剂随种撒施： 播种时将菌株CEF-193固体菌剂撒在种沟里，1 m 行长的菌剂用量为30 g。

发病调查：上述3 种处理均在发病后（播种后第60 天和第80 天） 按照1.2 所述方法进行病害调查。

1.4 棉花产量和纤维品质测定

棉花收获期在小区随机收取50 个吐絮棉铃用于检测纤维品质， 同时收取6.67 m2内的棉花计算籽棉产量。纤维样品送农业农村部棉花品质监督检验测试中心检测（HVICC 校准）纤维品质5 项指标（上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率）。

1.5 计算公式与统计方法

计算公式：DI＝Σ（Ni×i）/（N×4）×100，式中DI 为病情指数，Ni为各级病株数，i 为病级数值，N为调查总株数；E（%）＝（DI0－DI1）/DI0×100，式中E 为防治效果（防效），DI0为对照病情指数，DI1为处理病情指数[13]。

统计方法：采用SPSS（V22.0）软件进行平均值的差异显著性分析（t 检验法）。

2 结果与分析

2.1 CEF-193 对棉花黄萎病的温室防治效果

由表1 可见，在温室中，将真菌CEF-193 通过发酵液喷雾、发酵液灌根、固体菌剂混土3 种方式外施至棉花植株后，棉花黄萎病发病显著减轻。 其中固体菌剂处理的防治效果最好， 其次是灌根处理，再次是喷雾处理。

表1 温室中3 种接菌方式下CEF-193 对棉花黄萎病的防治效果

2.2 CEF-193 对棉花黄萎病的大田防治效果

如表2 所示， 在大田中， 播种后第60 天和第80 天， 固体菌剂随种撒施处理的病情指数显著低于相应对照，防效分别为33.8%和27.1%；发酵液灌根处理防效分别为22.2%和20.6%；发酵液喷雾处理防效略低， 分别为23.2%和15.5%。 3 种CEF-193 处理均显著减轻了棉花黄萎病的发病程度，其中固体菌剂随种撒施的防治效果最好。

2.3 CEF-193 对大田棉花纤维品质和产量的影响

在大田试验中，发酵液喷雾处理与相应对照相比，铃重增加了6.7%；发酵液灌根处理与相应对照相比，籽棉产量增加了8.4%，增产显著；固体菌剂随种撒施处理对棉花产量无显著作用。 3 种CEF-193处理对棉花纤维品质均无显著影响（表3）。

3 讨论与结论

棉花黄萎病的防治方式多样，其中生物防治安全性高，对环境影响小，易开发且成本低，不容易产生抗性问题，是防治黄萎病的重要手段[14]。 许多生防微生物可产生多种抗生素、 胞外酶等活性物质，在土传病害防治方面具有较好的应用前景[15-18]。 其中植物内生菌是研究的热点，已经取得一些研究成果，2014 年Li 等[11]在棉花上分离出642 株内生真菌，并从中筛选出7 株对棉花黄萎病菌具有较高抑菌活性的菌株， 分别为CEF-714（Leptosphaeria sp.）、CEF-642 （Talaromyces flavus）、CEF-026（Gibberella intermedia）、CEF-193 （Acremonium sp.）、CEF-325 （Fusarium solani）、CEF-818 （Penicillium simplicissimum）和CEF-109（Ascomycete sp.）。本研究进一步通过温室和大田试验， 对CEF-193 防治棉花黄萎病的效果进行了验证。

本研究先在温室中开展试验， 将CEF-193 通过发酵液喷雾、发酵液灌根、固体菌剂3 种方式处理棉花植株，发现处理后均显著减轻了棉花黄萎病的发病程度，其中固体菌剂处理的防效最好，达到了52.7%。 之后在大田中进一步验证，发现3 种处理均使棉花黄萎病发病显著减轻，防效在15.5%～33.7%。其中固体菌剂处理的防效最高，其次是发酵液灌根处理和喷雾处理。与已有报道的枝顶孢霉属内生真菌相比，CEF-193 的大田防效稍逊于CEF-082 和CEF-373[17]，但CEF-193 通过固体菌剂处理的方式也可取得较好的防效。 另外，CEF-193处理可使棉花增产。 其中，其发酵液喷雾处理的棉花铃重显著增加6.7%， 灌根处理的籽棉产量显著增加8.4%。

本研究验证了生防菌CEF-193 可以有效减轻黄萎病发病，并且可显著提高棉花产量，具有较好的应用前景，为棉花黄萎病的有效防治提供了技术支撑。