自噬缺陷在动脉粥样硬化中作用研究进展

李波 戴先鹏

[摘要] 自噬是一种亚细胞过程，在溶酶体降解蛋白质受损细胞器如线粒体过程中发挥重要作用。它对蛋白质和线粒体功能的调节和维持细胞稳态至关重要，而其失调则涉及多种疾病，如动脉粥样硬化。最近有研究表明，无论动脉粥样硬化斑块中是否存在自噬刺激因子（例如活性氧、氧化脂质和细胞因子），动脉粥样硬化进展期间都存在自噬缺陷。本综述重点介绍了动脉粥样硬化自噬缺陷的原因和后果，特别是对巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞的影响，对治疗动脉粥样硬化的自噬靶标可能具有重要意义。

[关键词] 动脉粥样硬化;自噬缺陷;巨噬细胞;血管平滑肌细胞;内皮细胞;细胞凋亡;衰老

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）24-0187-06

[Abstract] Autophagy is a subcellular process that plays an important role in the process of lysosomal degradation of protein-damaged organelles， such as mitochondria. It is essential for the regulation of functions of protein and mitochondria and the maintenance of cellular homeostasis. The disorder of autophagy is related to many diseases， such as atherosclerosis. Recent studies have shown that autophagy defects exist during the progression of atherosclerosis， regardless of the presence of autophagy stimulating factors（such as reactive oxygen species， oxidized lipids and cytokines） in atherosclerotic plaques. This review focuses on the causes and consequences of autophagy defects in atherosclerosis， especially the impact on macrophages， vascular smooth muscle cells and endothelial cells， which may be of great significance for the treatment of autophagy targets for atherosclerosis.

[Key words] Atherosclerosis; Autophagy defects; Macrophages; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Apoptosis; Senescence

動脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是大中动脉血管内膜中形成含脂质的斑块。动脉粥样硬化的危险因素包括高血压、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖和吸烟，此外也认为老化是导致这种疾病的重要因素。根据流行病学研究表明，包括心肌梗死和中风在内的动脉粥样硬化血栓性疾病的发病率和患病率与年龄呈正相关性。动脉粥样硬化斑块与主动脉瘤具有相似的病理特征，包括VSMCs衰老、ECM重塑和巨噬细胞介导的炎症[1，2]，但是动脉粥样硬化和腹主动脉瘤之间的关联尚不清楚[3]。尽管应用降胆固醇疗法（他汀类药物）、外科手术（球囊血管成形术和支架置入术）和改变生活方式（饮食和体育锻炼），动脉粥样硬化仍然是发达国家的主要死亡原因之一。因此，需要进一步探索斑块不稳定和破裂的机制以找到新治疗方法来预防并发症。最近有研究表明自噬缺陷在动脉粥样硬化斑块不稳定和疾病的整体发展中发挥重要作用。

自噬是一种亚细胞过程，主要生理功能是参与蛋白质和受损细胞器的降解。不同类型的自噬（巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬）取决于物质运送到溶酶体腔的输送途径。自噬的特征是吞噬双膜囊泡中的细胞质物质形成自噬体随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体。然后，吞噬的物质在溶酶体水解酶作用下水解为氨基酸、碳水化合物、脂肪酸和核苷酸。通过生物分子的再循环，自噬为细胞功能和体内平衡提供了所需的物质来源。然而，当细胞内（例如，受损细胞器的积累）或细胞外因素（如营养缺乏、缺氧）应激刺激时，触发自噬并保护细胞。在线粒体受损的情况下，通过PTEN诱导激酶（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）和Parkin活化引发线粒体自噬。在线粒体膜电位丧失后，PINK1在外膜上积聚，募集Parkin，促进功能障碍线粒体的自噬降解。然而，重要细胞成分的降解和过度刺激自噬可导致自噬性细胞死亡。自噬体与特异性自噬相关蛋白（Autophagy-related protein，ATG）如ATG5和ATG7有关。这些蛋白质又受多种上游信号因子的调节，如mTOR和AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）。在所有途径中，最广泛研究的是营养感应mTOR途径。在营养缺乏的情况下，mTOR被灭活使得自噬介导的物质和能量供应的产生。在营养过剩的情况下，mTOR活化使得自噬失活。AMPK位于mTOR的上游，其活化导致mTOR抑制和诱导自噬。本综述中，我们将讨论自噬在动脉粥样硬化中的作用，特别是自噬缺陷对斑块中巨噬细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）和内皮细胞（ECs）的影响。

1 动脉粥样硬化中的自噬

过去十年的研究已经发现动脉粥样硬化中存在自噬现象。透射电子显微镜显示自噬可以发生于人动脉粥样硬化斑块的所有细胞中（即巨噬细胞、VSMCs和EC）。对人颈动脉斑块标本的VSMCs进行分析显示，与正常健康的VSMCs相比，有丝分裂增加及PINK1水平升高[4]。然而，有症状和无症状患者的颈动脉斑块的比较显示，LC3-Ⅱ的表达降低了5倍。此外，对人和小鼠动脉粥样硬化斑块分析证明p62与斑块共定位于巨噬细胞中[5]。小鼠动脉粥样硬化斑块中p62的表达也随着年龄和斑块负荷的增加而进一步升高[6]。

鉴于其在多泛素化蛋白质靶向自噬体降解过程中的作用，动脉粥样硬化斑块中p62水平的增加可反映出自噬缺陷。事实上，自噬缺陷可能发生于两个不同的阶段：（1）起始阶段的缺陷，即自噬体的形成/成熟的阶段;（2）与溶酶体融合阶段和（或）溶酶体介导的降解过程中的缺陷。有研究表明动脉粥样硬化中的自噬缺陷主要是由溶酶体依赖性途径缺陷引起。晚期斑块中的自噬在形成蜡样脂过程中发挥重要作用。此外，广泛或持久的氧化应激可破坏溶酶体膜的完整性，导致溶酶体水解酶的释放并且不能充分去除受损的线粒体。此外，细胞色素c从受损的线粒体中释放出来并可能促进细胞凋亡。最终，晚期动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇晶体会破坏溶酶体膜，从而破坏自噬过程。这些发现表明晚期动脉粥样硬化可破坏溶酶体介导的吞噬物降解，而不是破坏自噬体形成/成熟。因此，晚期病变中仍然可以激活自噬，以响应斑块中存在的自噬诱导物如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、氧化脂质和内质网（Endoplasmic reticulum，ER）应激，但该过程在第二阶段缺陷，这取决于溶酶体依赖性吞噬物的降解。因此，溶酶体系统的功能，特别是转录因子EB（Transcription factor EB，TFEB）的作用，是溶酶体生物合成和自噬的主要调节因子，现已成为动脉粥样硬化和其他脂质代谢相关疾病领域研究的重要课题[6，8，9]。另外，自噬是功能性的，但无法应对随后斑块中出现的过量氧化应激，导致细胞凋亡。因此，细胞保护性自噬途径可能变成自噬性细胞死亡途径，这取决于斑块的发育阶段。

2 自噬在巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞中的作用

体外实验表明，不同的动脉粥样硬化相关刺激在巨噬细胞、VSMCs和EC中可激活自噬。

在巨噬细胞中，自噬可以通过氧化修饰形成氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，oxLDL）和7-酮胆固醇直接或间接诱导ER应激。自噬通过受损蛋白质和细胞器的清除来促进巨噬细胞存活。此外，自噬通过调节溶酶体对脂滴的降解来促进巨噬细胞和泡沫细胞中游离胆固醇的释放。巨噬细胞中的线粒体自噬可用不同物质（如LPS）诱导，并且需要p62重新定位到线粒体。功能丧失实验表明受损线粒体的p62依赖性清除可以抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）介导的炎症。

与巨噬细胞相似，氧化脂质可激活VSMCs自噬并促进细胞存活。脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）可以激活VSMCs自噬，通过诱导ER应激来刺激4-HNE-修饰蛋白的清除。已证明oxLDL可刺激线粒体自噬作为抗VSMCs凋亡的保护机制[7]。人VSMCs与oxLDL接触会引发线粒体自噬，这与PINK1和Parkin在受损线粒体外膜上的积聚有关[7]。此外，VSMCs自噬也可能受不同细胞因子（如骨桥蛋白、TNF-α）和血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）的调节。后者通过AMPK和mTOR非依赖性机制诱导VSMCs自噬，并保护VSMCs免受4-HNE诱导的细胞死亡。此外，PDGF促进形成不同VSMCs表型，其特征是迁移和增殖能力增强，收缩蛋白表达降低和VSMCs表面标志物的表达上调，表明自噬也可以影响VSMCs的表型和增殖。

同样，在EC中也证明oxLDL可激活自噬以传递对内皮损伤的保护作用[10]。在摄取oxLDL后，转移脂质到自噬体体内经溶酶体降解。然而，oxLDL也可能通过诱导ER应激引发自噬。X-box结合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）的mRNA剪接通过Beclin 1转录激活触发EC自噬反应，Beclin 1是自噬中的关键组分。此外，晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products，AGEs）等致动脉粥样硬化因子引发EC自噬以防止内皮损伤。此外，已证明当EC受到血管壁上的层流血流引起的剪切应力时，可刺激自噬[11]。值得注意的是，只有高剪切力才能刺激EC中的保护性自噬，而低剪切应力通过mTOR活化和AMPK途径抑制引起内皮自噬缺陷[11]。此外，用棕榈酸处理EC会触发PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，以控制线粒体质量并防止EC损伤。除了能够调节EC的存活外，自噬还涉及许多其他功能，如一氧化氮（Nitrous oxide，NO）产生、血管生成和血栓形成[12]。

通过细胞类型特异性自噬缺陷小鼠模型以研究自噬在巨噬细胞、VSMCs和EC中的作用。巨噬细胞中必需自噬基因Atg5的缺失导致ROS增加、细胞凋亡增加和细胞功能减退。后者表明吞噬细胞很难识别并清除因自噬缺陷而凋亡的巨噬细胞。此外，已证明巨噬细胞中的自噬缺陷会影响胆固醇合成，并且在用LPS和胆固醇晶体治疗时可导致白细胞介素-1β（interleukin-1-beta，IL-1β）分泌增加。重要的是，巨噬细胞Atg7的缺失导致类似的效应，表明巨噬细胞的行为变化是由自噬的一般缺陷引起，而不是特异性自噬相关基因的缺陷引起。

与巨噬细胞不同，小鼠VSMCs Atg7的缺失不会诱导细胞凋亡，但会引发应激诱导的过早衰老，这是一种不可逆的生长停滞状态，细胞保持代谢活跃，并经历多种形态和功能变化。例如，Atg7缺陷型VSMCs核肥大、p16/RB介导的细胞周期停滞和衰老相关的β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，SAβG）活性減弱。Atg7缺陷型VSMCs还可以增加胶原蛋白含量、迁移潜力以及细胞因子转化生长因子β（Transforming growth factor-beta，TGF-β）和基质细胞衍生因子1（SDF1）的蛋白质表达。根据实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析，Atg7缺陷型VSMCs显示IL-1β和NLRP3的mRNA水平增加，这表明炎症过度活跃。Gardner等最近所述所有这些发现均符合人衰老VSMCs的典型特征，除了胶原蛋白含量增加。虽然小鼠衰老不同于人类，但不能排除增加的胶原蛋白含量可能与其他细胞通路的激活有关，而不是衰老表型本身的一部分。

当它们作为细胞保护途径时，自噬与衰老呈负反馈，假定自噬为对抗细胞衰老的适应性反应机制[16，17]。通过清除损伤的线粒体和蛋白质聚集体，自噬可以分别抑制氧化和蛋白毒性应激的积累，因此可以负调节细胞衰老。已知老年组织中自噬标记物的表达减少及自噬相关基因的组织特异性敲除导致不同小鼠模型中早期衰老表型的发展。已证实mTOR抑制剂雷帕霉素诱导自噬可以抑制衰老[14，15]。

4.3 为什么自噬缺陷不会导致巨噬细胞衰老？

研究表明自噬受损的巨噬细胞不会发生细胞衰老。已经提出一些假设，但仍不清楚自噬缺陷型巨噬细胞不会衰老的原因。第一个假设与细胞内p62的水平有关。与VSMCs相比，Atg7缺陷型巨噬细胞的p62 mRNA表达水平未增加。因此，自噬缺陷型巨噬细胞中相对低水平的p62可能不能诱导衰老或激活Nrf2-ARE途径。此外，巨噬细胞特异性Atg5缺陷型LDLR-/-小鼠的p62缺失并未改善，但会增加这些小鼠的致动脉粥样硬化表型[5]。与p62感受态小鼠相比，这些双敲除小鼠的斑块的特征是凋亡增加、坏死、炎症和不溶性多聚化蛋白的积累[5]。此外，由于缺乏p62依赖的炎性复合体清除，动脉粥样硬化的增加与动脉粥样硬化的增加有关，最近被描述为“在肉瘤中”[18]。

第二个假设是细胞对压力的反应，这似乎是由它们的起源预先确定的。一般而言，血细胞生成细胞和生殖细胞通过细胞凋亡来应对压力，而间充质细胞（例如成纤维细胞样细胞）通过参与衰老程序来应对压力。因此，VSMCs和巨噬细胞对自噬缺陷的反应不同可能在于起源不同。

第三个假设是细胞增殖和更新的能力。假定高度增殖细胞更容易因压力而衰老，尽管情况恰恰相反。快速分裂细胞（如造血细胞和生殖细胞）在端粒缩短时会发生细胞凋亡而不是衰老。因此，这是一个需要进一步实验证实的研究领域。

4.4 为什么自噬缺陷会导致巨噬细胞凋亡？

自噬缺陷型巨噬细胞中细胞凋亡易感性增加可能与细胞中ROS产生增加有关。有研究表明基本自噬蛋白的丧失通常与功能障碍的线粒体和ROS的累积增加有关，并且经常导致细胞死亡（凋亡）。这些发现与自噬作为管家和细胞保护机制的作用一致。通过限制氧化损伤和清除功能失调的线粒体响应ROS，随后激活自噬以恢复体内平衡。因此，自噬缺陷可以导致ROS积累，反过来可以引发凋亡性细胞死亡。此外，线粒体自噬清除功能失调的线粒体，并且通过减少细胞色素c和其他促凋亡因子的释放来预防细胞凋亡[7]。在营养物质耗竭的情况下，线粒体发生线粒体膜透化（Mitochondrial membrane permeabilization，MMP），但内源性营养素的自噬依赖性供应可逃避细胞死亡。然而，当自噬受到抑制时，细胞的生物能量状态达到绝对最小值，不再清除发生MMP的线粒体，从而发生细胞凋亡。总之，认为自噬缺陷是氧化应激和细胞凋亡的主要原因，是动脉粥样硬化斑块去稳定化的已知因素。

4.5 为什么自噬缺陷会导致EC的凋亡和衰老？

与巨噬细胞和VSMCs不同，EC在自噬缺陷的同时发生细胞凋亡和衰老。已知EC自噬具有细胞保护作用，因此自噬缺陷可能导致凋亡。例如，抑制自噬可以消除过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导细胞凋亡的作用。此外，过量的oxLDL会通过上调LOX-1清道夫受体阻碍保护性自噬反应，引发EC凋亡性死亡。体内实验证实，EC特异性Atg5敲除小鼠的血管显示EC凋亡率增加。然而，p53阳性细胞核增加可能与细胞凋亡无关，因为p53是引发衰老的急性DNA损伤反应途径的核心组成部分。值得注意的是，EC在衰老时可以获得一种原始表型。事实上，衰老EC对细胞凋亡刺激（如TNF-α、oxLDL和神经酰胺）较年轻EC更敏感，这可能是由于NO水平降低和ROS诱导损伤增加所致。因此，自噬缺陷EC的命运是衰老和细胞凋亡共同发生。由于适当的自噬对于保持EC功能至关重要，并且内皮功能障碍有助于动脉衰老，因此假设内皮自噬缺陷在衰老相关的动脉功能障碍中发挥直接作用。然而，需要进一步研究来确定自噬缺陷如何促进EC衰老。

5 检测自噬和衰老的潜在缺陷

可以通过不同的方法检测自噬，例如透射电子显微镜、蛋白印迹和免疫组织化学。这些技术都有其优点和局限性，如果不清楚其局限性，可能会对结果作出错误判断[19]。此外，研究衰老过程中的自噬需要考虑一些额外因素，尤其是衰老相关的SAβG染色作为衰老标志物。SAβG是一种由衰老细胞表达的溶酶体酶，在氢离子浓度指数（Hydrogen ion concentration，pH）为6时具有最佳活性，可能反映衰老过程中溶酶体质量的增加。使用溶酶体抑制剂的实验需要详细解释，因为它们可以通过增加溶酶体pH来阻断自噬流体，从而可能错误地增加SAβG的水平。此外，由于膜与自噬体融合，自噬诱导的特征通常是溶酶体大小的增加，其可以影响SAβG染色。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在化疗诱导衰老中的使用不稳定，因为它可以加强化疗诱导的细胞凋亡，从而干扰衰老率。另外，p53途径上调不仅是细胞凋亡的標志物，还可能表示衰老。

6 动脉粥样硬化自噬的药理学刺激

本综述中描述了动脉粥样硬化斑块进展过程中自噬如何缺陷以及如何影响斑块的稳定性。因此，我们建议刺激自噬作为动脉粥样硬化的治疗靶标。他汀类药物家族的降胆固醇药物具有很多作用（如抗炎作用、改善EC功能和稳定斑块）[20]，已证明通过部分抑制mTOR通路刺激VSMCs自噬。最近发现其还具有抗衰老作用。他汀类药物可预防EC和VSMCs衰老，这可能是由于它们能够限制端粒缩短和氧化端粒DNA损伤。除他汀类药物外，目前正在研究其他自噬刺激性化合物作为潜在的斑块稳定疗法。迄今为止，最有希望的化合物之一是雷帕霉素[或雷帕霉素衍生物（例如依维莫司）]，其通过抑制mTOR通路来刺激自身免疫。除了对药物洗脱支架中VSMCs增殖的抑制作用外，这些mTOR抑制剂可引发一系列抗动脉粥样硬化的作用，包括斑块巨噬细胞的消耗、胆固醇的改善、降低全身和局部炎症以及抑制斑块内新生血管形成。此外，已证明mTOR抑制剂可抑制细胞衰老并延长各种动物的寿命[21]。这些数据被血糖和血脂水平所掩盖，因此建议联合使用二甲双胍或他汀类药物治疗。此外，小鼠连续给予依维莫司治疗导致mTOR过度活化和耐受以及肝组织中自噬减少[22]，因此建议采用间歇给药方案。值得注意的是，mTOR抑制的部分有利效果与自噬诱导有关。mTOR抑制剂的一些有利效果仅基于细胞增殖的抑制。抗糖尿病药物二甲双胍通过激活AMPK间接刺激自噬和抑制mTOR。已知二甲双胍可以减少糖尿病患者的并发症，这可能超出其低血糖效应。二甲双胍抑制血管衰老和炎症，并可减轻糖尿病[23]和非糖尿病ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化[24]。二甲双胍还通过AMPK依赖性方式减少线粒体碎片来改善线粒体质量[23]。虽然最近的研究表明二甲双胍对EC的抗炎作用具有自噬依赖性[24]，但需要进一步研究来确定二甲双胍有益于心血管的功能是否与自噬诱导有关。

因為线粒体自噬在动脉粥样硬化中必不可少，所以需要新的药理学化合物。通过抑制mTOR激活自噬可能足以清除受损的线粒体，尽管这是促进有丝分裂的非选择性方法。线粒体融合（即片段化）或融合调节可能是靶向激活线粒体自噬的策略。例如，用动力蛋白相关蛋白1抑制剂mdivi-1治疗可减少线粒体碎片并减弱糖尿病ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化[23]。然而，在这项研究中未阐明对线粒体自噬的特殊影响。用特异性线粒体靶向抗氧化剂治疗可能是控制线粒体质量的另一种方法。尽管这些药物可能无法改善清除受损线粒体，但它们可以阻止mtROS积累，从而抑制线粒体损伤并改善线粒体自噬[25]。

7 结论

在过去的几年中，自噬已成为治疗动脉粥样硬化的新型治疗靶点。多项研究表明自噬在动脉粥样硬化进展期间失调;因此，研究其对斑块稳定性的影响非常重要。有趣的是，自噬的遗传破坏可能对巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞产生相反的作用。巨噬细胞通过细胞凋亡来应对自噬缺陷，而VSMCs通过衰老，尽管这两种现象都可促进斑块进展。因此，可以认为自噬是衰老和细胞凋亡之间的敏感控制开关。当自噬受损时，细胞有两个主要选择：死亡（通过凋亡）或适应（通过衰老）。然而，自噬缺陷的EC可以同时发生细胞凋亡和衰老。尚不清楚这些细胞类型特异性差异的原因，但可能涉及接头分子p62积累或可能仅取决于细胞的起源和（或）增殖能力。尽管如此，研究发现p62在VSMCs衰老中发挥重要作用，因此可着重关注p62参与EC衰老和其他与年龄相关的过程。对于动脉粥样硬化的治疗，尽管可能发生细胞类型依赖性效应，但仍然支持使用自噬刺激方法。此外，过度诱导自噬可能引发自噬性细胞死亡，因此建议使用适当剂量。目前才开始特定研究线粒体自噬的药理学方法的发展，但鉴于其在线粒体质量控制和衰老方面具有重要意义，可认为它们在未来治疗心血管疾病方面具有非常重要的价值，未来的研究重点放在自噬/线粒体自噬刺激药物的开发和测试上，优选具有抗衰老潜力的药物。这种双重作用的药物不仅对动脉粥样硬化的治疗有积极作用，而且对于与年龄相关的心血管疾病也是如此。

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（收稿日期：2020-01-02）