利用AuNCs@GSH-CAP体系荧光增强检测BSA的研究

程凯旋，尹建行，徐 娜*

(1.吉林化工学院 材料科学与工程学院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

蛋白质是生命活动的基础,许多重要的生命现象和生理活动都是通过蛋白质实现.蛋白质含量的变化与疾病息息相关,因此许多疾病相关蛋白的检测在病理学、基因组学等方面有重要的参考价值[1].

金纳米簇(AuNCs)是一种新型的荧光纳米材料，其由几个乃至上百个的金原子组成，尺寸都是在纳米级别，因此它的相关性质也是介于金原子和金的大纳米粒子之间的.因为金纳米粒子具有独特的尺寸效应和良好的生物相容性，以及易于制备和生物功能化修饰，且具有发光性能好持续时间长、低毒性、反应灵敏等特点，成为一种很有发展潜力的新型荧光探针[2-3].

本文首先利用谷胱甘肽(GSH)为保护剂、三水合四氯金酸氢(HAuCL4·3H2O)为还原剂，合成出金纳米簇(AuNCs@GSH)，再加入CAP使金纳米簇发生荧光猝灭得到(AuNCs@GSH-CAP)体系作为荧光探针，用于检测BSA.通过实验发现，发生荧光猝灭的金纳米簇遇到BSA后，体系荧光强度有明显的增强，并使用该方法对BSA的检测限、线性范围和选择性等进行初步的讨论[4-7].

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

三水合四氯金酸氢(HAuCL4·3H2O)、谷胱甘肽(GSH)和氯霉素(CAP)购买于阿拉丁试剂有限公司(中国上海)，牛血清白蛋白(BSA)，其余实验试剂：氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、硝酸钾(KNO3)、碳酸钠(NaCO3)均购于天津市永大化学试剂有限公司，氨基酸(Met、Pro、Gly、Thr)均取自北京鼎国长胜生物科技有限公司(中国北京)，所有试剂均为分析纯.超纯水用于整个实验过程.

观察荧光效果用ZF-20D暗箱三用紫外分析仪，紫外波长254、365、254、365 nm，仪器功率40W(上海骥辉科学分析仪器有限公司)，荧光光谱采用F97XP荧光分光光度计测定，波长范围：200～900 nm，波长精准度：±0.4 nm(上海棱光).紫外可见光谱用UV-2200双单色器双光束紫外可见分光光度计测定，波长范围：190～1 100 nm，波长精准度：±0.25 nm(北京瑞利仪器).

1.2 实验过程

1.2.1 AuNCs@GSH的制备

HAuCL4溶液(25 mol/L，0.4 mL)与GSH溶液(25 mol/L，0.6 mL)和4 mL超纯水，在室温下剧烈搅拌至混合物变为无色，然后在70 ℃水浴加热条件下，继续温和搅拌24 h，得到金纳米簇，最后将所得溶液在4 ℃条件下冷藏保存[8].

1.2.2 AuNCs@GSH-CAP体系对不同浓度的BSA的检测

在完全相同的AuNCs@GSH溶液(2 mL)中加入相同浓度的CAP(400 μL)，混合均匀发生荧光猝灭后，分别加入不同浓度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，固定激发波长360nm处测试其荧光光谱.

1.2.3 AuNCs@GSH-CAP体系对BSA的选择性检测

2 结果与讨论

2.1 AuNCs@GSH的表征

图1是金纳米簇的荧光发射谱和紫外谱图，在紫外线波长为225～250 nm之间出现一个最大吸收波长243 nm，而在250～500 nm时没有出现新的吸收峰，因此可推断该荧光探针中没有形成大粒径的金颗粒.在波长为575～625 nm之间AuNCs@GSH的荧光强度出现峰值.

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2.2 AuNCs@GSH-CAP体系对BSA的检测性能分析

由图2(a)可以看出，AuNCs@GSH自身荧光强度较高，只加入CAP后荧光强度下降，这说明CAP使金纳米簇发生荧光猝灭；在加入BSA后，荧光强度相较于只加入CAP明显提高，这说明BSA能够增强加入CAP后的金纳米簇荧光强度.

如图2(b)是AuNCs@GSH-CAP体系加入相同量的BSA后，随着时间增加，0～10 min内其荧光强度的图，在整个孵育过程中，每隔1 min取一个样进行检测，发现0 min时荧光强度最弱，孵育1 min后荧光强度基本达到峰值，之后的时间里荧光强度趋于稳定的，这说明体系响应时间较短，由此可以确定整个孵育时间为1 min，因此确定AuNCs@GSH-CAP体系可以对BSA进行检测.

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在完全相同的AuNCs@GSH溶液中加入相同浓度的CAP，混合均匀发生荧光猝灭后，分别加入不同浓度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，放入荧光光度计进行分析，如图3(a)所示，在613 nm为波长的荧光光谱中，在未加入BSA时，AuNCs@GSH因为CAP发生荧光猝灭反应，使其荧光强度较弱，随着BSA的加入和浓度的增加，荧光强度随之增加，由此可以得出BSA有着使AuNCs@GSH-CAP体系荧光增强的能力.

图3(b)是AuNCs@GSH-CAP体系中加入BSA后的荧光强度差值与BSA浓度的关系图，可以看出两者是线性关系，其线性范围10～160 μmol/L，线性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其检测限为0.1 μmol/L[9].

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2.3 AuNCs@GSH-CAP体系对BSA的选择性

图4 抗干扰检测

2.4 检测机理的研究

对AuNCs@GSH-CAP体系检测BSA的检测机理进行研究，如图5所示，在加入BSA后的AuNCs@GSH-CAP体系其吸收强度明显增强.而BSA对CAP的作用属于静态猝灭作用的特征，且反应是自发的吸热反应.对于药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子常借助疏水作用力、氢键、Vander Waals力和静电引力等相互结合形成超分子复合物，而CAP与BSA间的结合主要是氢键作用力和Vander Waals力，且在结合过程中产生了明显的焓、熵负效应.因此使得AuNCs@GSH-CAP体系荧光强度增强[10].

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3 结 论

综上所述，可以利用BSA使AuNCs@GSH-CAP体系荧光增强效果来检测BSA，两者在10～160 μmol/L范围内呈线性关系，其线性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其检测限为0.1 μmol/L.该荧光探针制备过程简单、易操作、条件温、响应迅速、并且该探针相较于其他探针，具有良好的选择性和抗干扰性，灵敏度高、检测结果准确且荧光效果明显.在实验过程中取得良好的实验效果，具有较好的发展前景.