CSE下调抑制MCF-7细胞生长增殖的研究

邹桃

【摘要】目的：下调或者降低CSE的含量来研究对于乳腺癌细胞MCF-7的生长增殖影响。方法：MCF-7转染siRNA，western-blot的方法来检测细胞表达量，将获得的实验组和对照组的蛋白含量的灰度值比较，从而确定CSE含量是否得到下调。MTT实验分别检测对照组和实验组细胞生长活力的差异。从而确定CSE下调是否抑制细胞生长。然后通过细胞周期检测来获得细胞的生长增殖情况。结果：siRNA使CSE表达减少，MTT显示实验组明显比对照组细胞活力有所降低，差异显著性分别为p<0.01，p<0.05，细胞周期检测结果显示CSE下调明显抑制MCF-7增殖，使细胞生长周期阻滞在s期，与对照组比较有显著差异性。实验结论：通过转染siRNA的方法使乳腺癌细胞中CSE含量减少，并且CSE的下调明显抑制了细胞的生长和增殖。

【关键词】CSE  MCF-7  乳腺癌细胞 生长增殖

一、绪论

（1）乳腺癌目前研究。目前乳腺癌前病变机理的研究，从分子水平上对癌症的研究渐渐成为热点。肿瘤标志物越来越成熟，可用来研究更多的新的原癌基因、抑癌基因，研究细胞凋亡基因和信号传导基因等，来了解乳腺癌细胞治疗的方法和突破点，而有利于早期的诊断、早期的预防治疗和后期的复检，方便临床对乳腺癌进行具体分析具体分析。并且采取合理有效的措施。

（2）CSE与硫化氢。最近研究表明硫化氢由胱硫醚β合成酶（CBS），胱硫醚γ裂解酶CSE和3-巯基丙酮酸硫基转移酶催化生成，CBS和CSE在细胞浆内生成硫化氫是以L-半胱氨酸作为底物。由此我们可以联想到从CSE的层面，来降低硫化氢的表达量，就会对细胞的生长和增殖起到一定的作用。

二、实验方法

（一）MCF-7细胞培养

含10 %血清的RPMI-1640培养基在37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养至对数生长期。

（二）western-blot检测对照组和经过转染后乳腺癌细胞中CSE表达量及相应细胞活力检测

（1）细胞种板和转染种六孔板，细胞密度30%-50%，第二天，每孔转染方式如下：a将20pmolsiRNA溶于50ul1640无血清培养基中。b将1ul lip2000溶于50ul无血清1640培养基中，轻弹混匀室温放置5min。c，将a、b两管混合，混匀后放置20min。转染期间，将6孔板中的培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将c管混匀加入6孔板其中一孔中，另一个孔中加入scRNA，4-6小时换成有血清培养基。培养48h。

（2）提取蛋白和wetern-blot：分别收集处于对数生长期的对照组和转染siRNA的MCF-7细胞;用离心机3500rpm 5min离心，弃上清;向加入1mlpbs，吹匀，移到EP管中，3000rpm 5min;将Ep管中的上清液弃去;离心管加入RIPA和PMSF（100：1）细胞裂解液， 冰上裂解30 min;裂解完后，用12000rpm，15min，4℃离心;取一部分上清进行蛋白定量，另一部分处理后进行跑胶80v30min之后转为120v100min;总蛋白经SDS-PAGE胶电泳分离后， 转移至PVDF膜上， 室温下用5%脱脂牛奶封闭lh;加入一抗4 ℃过夜， 洗膜3次后， 加入二抗后室温孵育1 h， 再洗膜3次， 经化学发光系统（Alpha， USA）检测蛋白表达水平。β-actin为内参蛋白。

（3） MTT检测法检测对照组和转染SiRNA组细胞活。收集对数生长期的MCF-7及转染后的MCF-7细胞，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，在37 ℃、5 % CO2、饱和湿度培养箱中培养12h。待细胞贴壁后，10 μl的5 mg/ml的MTT加入每个孔中，继续培养4 h，弃去上清液，然后加入100 μl的DMSO，慢慢摇晃，使结晶逐渐溶解。最后用酶标仪测定在570 nm波长处的吸光度值（OD值），接下来计算细胞存活率，存活率=（实验孔OD值/对照孔OD值）×100%

（三）流式细胞仪检测凋亡和细胞周期

（1）收集细胞先向种好的六孔板中每孔加入500ul0.25%的胰酶，再分别加入1ml培养基，终止消化。吹打收集入离心管。

（2）细胞的固定收集之后转速1500r/min离心5min弃上清，用预冷的PBS洗一遍，再加入300～500 ul预冷的PBS将细胞重悬。将细胞悬液缓慢逐滴加到10 ml预冷的75%乙醇（用PBS配置）中，用手轻弹。保存到-20度，一周内检测。

（3）细胞周期的检测固定好之后，进行周期的检测。取出固定好的细胞，放入离心机中，转速1500r/min，10 min，再用预冷的PBS洗两次，每管加入300～500的DNA染色液（现用现配），需避光放置于37度条件下染色20分钟。最后用FACS Calibui BD流式细胞仪检测细胞周期。

（4）统计学处理所有得到的数据采用SPSS17.0应用软件，进行统计学分析。数据均以x?± S表示，组间差异显著性采用t来检验，p﹤0.05表示组间的差异具有显著性，p﹤0.01表示组间的差异非常显著。

三、实验结果

（1）两株乳腺癌细胞MCF-7转染CSE siRNA，作用48h。转染后的实验组和对照组相比，显影结果显示出转染后CSE的表达量明显减少，表明转染后下调了CSE表达量。

（2）MTT实验结果表明转染siRNA的实验组细胞存活率比对照组存活率显著降低（p<0.01）CSE下调抑制了细胞的生长活力。

（3）CSE下调阻滞了细胞周期并抑制了乳腺癌细胞的增殖流式细胞仪检测出的结果表明经过转染实验组相比于对照组，细胞周期明显阻滞于s期，s期为细胞DNA复制合成期。下调CSE的表达量，能够很明显的使细胞周期阻滞在s期，即阻滞了DNA的合成，因此可以得出CSE的下调抑制了MCF-7细胞的增殖。

四、结论

MCF-7细胞转染SiRNA后，CSE表达量降低。CSE的下调抑制了乳腺癌细胞的生长。CSE的下调使细胞周期阻滞在s期，抑制了细胞的增殖。

参考文献：

[1]Kmnar A， Pant  MC， Singh  HS， et al. Determinants of oxidative stress and DNA damage （8-OhdG） in squamous cell carcinoma of head and neck [J].Indian J Cancer， 2012.

[2]王天晓.内源性胱硫眯-Y一裂解酶/硫化氢调控HepG2细胞凋亡[D].开封：河南大学，2015.