盐渍辣椒细菌多样性分析

赵玲艳，黄嘉欣，杨 剑，卿煜维，潘金微，周 熠，邓放明,

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.辣妹子食品股份有限公司，湖南 长沙 413100）

盐渍辣椒即新鲜辣椒经清洗、切碎（或不切碎），添加15%～25%食盐、0.05%～0.1%左右的CaCl2，0.05‰～0.1‰焦亚硫酸钠拌匀、装袋、贮存后的产品[1]。盐渍辣椒具有食盐含量高、保质期长、运输方便等特点。盐渍辣椒经脱盐、调配、罐装、杀菌等处理后，可加工成低盐调味辣椒，因此，盐渍辣椒已经成为全国辣椒加工企业的主要加工原料[2]。近年来，针对盐渍辣椒的研究大多集中在菌种的分离纯化、发酵工艺的优化和营养成分变化等[3-7]。盐渍辣椒因其食盐含量高，大部分微生物的生长受到抑制，但仍有部分耐盐微生物生长，以维持盐渍辣椒的缓慢发酵和较长的贮藏期。采用传统分离培养的方法，可以分离出盐渍辣椒中许多耐盐微生物，然而传统的分离培养大多仅利用可培养的微生物，自然界中可分离培养的微生物不到总微生物的1%，自然发酵辣椒中还有绝大多数不可人工培养和暂未人工培养的微生物。并且针对盐渍辣椒贮藏过程中微生物的研究仅局限于菌种的分离培养，其微生物多样性研究鲜有报道[8-9]。454高通量焦磷酸测序技术堪称宏基因组技术发展史上的一个里程碑，该技术可以对数百万个DNA分子同时测序，具有速度快、单个碱基的测序费用低、简单、高效、方便等特点[10-15]。Liu Zhanggen等[16]研究了江水酸菜中的主要微生物的组成；周森等[17]将传统培养分离方法和高通量测序技术相结合，解析了大曲中微生物的组成情况；韩俊燕等[18]发现剁辣椒中魏斯氏菌、明串珠菌和乳杆菌是主要的菌属。

本研究采用454焦磷酸测序技术，对盐渍线椒和盐渍米椒的细菌多样性进行研究，探明盐渍线椒和盐渍米椒细菌群落结构和相对丰度，挖掘盐渍线椒和盐渍米椒中有益微生物资源，旨在为进一步对盐渍蔬菜进行质量监控、改进生产工艺、提高产品品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

盐渍线椒和盐渍米椒来自湖南坛坛香食品科技有限公司。

盐渍线椒：切碎盐渍，原料为山西忻州的‘辣丰3号’线椒，切碎后添加约21%的食盐和0.2% CaCl2，混匀，入袋贮藏。

盐渍米椒：原料为云南小米椒，添加约14%的食盐、0.2% CaCl2、0.6%柠檬酸，混匀，整只盐渍，入袋贮藏。

1.1.2 试剂

E.Z.N.A.®Soil DNA试剂盒、TransStart FastpfuDNA聚合酶、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、Roche GS FLX Titanium emPCR Kits、Roche GS FLX+ Sequencing Method、Manual_XLR70 kit 北京Omega BioTek公司。

1.2 仪器与设备

DYY-6C型凝胶电泳仪 北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；Quanti Fluor™-ST荧光定量系统 美国Promega公司；Roche GS FLX测序仪 瑞士Roche公司；UVP CDS-8000凝胶成像系统美国Metone公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

打开盐渍线椒和盐渍米椒的编织袋后，通过观察袋中辣椒的色泽和闻袋中辣椒的气味，分别选择5 袋风味较好的盐渍线椒和盐渍米椒为取样对象，撇去袋中表面厚约20 cm的辣椒，每袋无菌操作取样500 g，于EP管中密封带回实验室，分别将盐渍线椒和盐渍米椒的5 个样品混匀，取样，每份100 g，一式三份，盐渍线椒标号为X_G，盐渍米椒标号为M_G，于－80 ℃超低温冰箱中保存。

1.3.2 样品中微生物DNA的提取及DNA质量检测

参照E.Z.N.A.®Soil DNA试剂盒抽提方法对盐渍辣椒中微生物DNA提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA[19]。

1.3.3 扩增产物定量及测序

正反向引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；533R：5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），带有5’端454测序A、B接头的特异引物和3’端的融合引物，其中A为测序端，需要加上barcode，B端引物可以共用。PCR采用20 μL反应体系[20]，具体见表1。

表1 PCR扩增体系Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环，72 ℃最后延伸10 min。切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。

1.3.4 PCR产物定量、测序

PCR产物荧光定量，确保总量大于100 ng，PCR产物质量浓度大于5 ng/μL，OD260nm/OD280nm介于1.8～2.0之间，无降解，将PCR产物混合，按照454 Roche GS-FLX测序[21]。

1.3.5 生物信息分析

为了提取高质量核苷酸序列，使用Qiime [1]（vsesion 1.17）软件去杂后，进行高质量序列的生物信息学处理，包括去除嵌合体、可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类、分类学分析、比对分析等[22-24]，应用到的数据库和软件见表2，利用R语言工具绘制群落结构组分图、Heatmap图、Rank-Abundance曲线、Shannon-Wiener曲线、主成分分析等[25-27]。

表2 生信分析数据库或软件Table 2 Bioinformatics software or databases used in this study

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果

从图1可以看出，从样品X_G和M_G中提取的微生物基因组DNA质量浓度大于5 ng/μL，无明显降解，适合进行后续PCR实验。

图1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total bacterial genomic DNA from salted peppers

2.2 基因组DNA PCR扩增结果

1%琼脂糖凝胶电泳检测微生物总DNA合格后，扩增微生物总DNA的16S rRNA V1-V3区，PCR产物经回收、洗脱、2%琼脂糖电泳检测[28]，结果见图2。

图2 盐渍辣椒细菌PCR产物电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the V1-V3 region of the bacterial 16S rRNA gene sequence from salted peppers

从图2可以看出，样品X_G和M_G中微生物总DNA的16S rRNA V1-V3区PCR扩增产物条带均整齐、明亮、非特异带少，长度均约525 bp，条带大小正确，浓度合适，PCR扩增效果良好，适宜后续实验。

2.3 有效序列统计结果

M_G和X_G细菌总序列数为31 373 条，细菌的总碱基数为12 670 729 bp，细菌序列的平均长度为430 bp。有效序列经去除冗余、去重复处理后，优化数据统计，M_G和X_G细菌总碱基数为10 313 535 bp，序列总数为24 175 条，平均长度为426 bp。

2.4 X_G和M_G细菌多样性评估结果

优化序列在相似度为97%的水平下进行OTU聚类，X_G和M_G细菌的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数结果见表3。

表3 盐渍辣椒在97%相似性水平下细菌多样性指数Table 3 Diversity indexes of bacterial community at 97% similarity level in salted peppers based on 454 pyrosequencing data

从表3可以看出，X_G和M_G细菌的OTU值均小于ACE指数和Chao1指数，说明在X_G和M_G中可能很多未知的微生物资源；X_G细菌的OTU值、ACE指数、Chao1指数和Simpson指数大于M_G，Shannon指数小于M_G，说明X_G的细菌多样性大于M_G的细菌多样性。产生此现象的主要原因可能有以下2 个方面：其一是因线椒原料的含水量较米椒高，辣椒素含量较米椒低，线椒原料可能更适合微生物生长；其二是因2 种辣椒盐渍时食品添加剂的使用不一样，线椒盐渍时未添加柠檬酸，仅借助于高盐（质量分数21%）抑制微生物的生长，达到较长时间保胚的目的。而米椒盐渍时因添加了0.6%柠檬酸，适当降低了食盐用量（质量分数14%），低初始pH值和较高食盐浓度的共同作用抑制了微生物的生长，降低了其微生物多样性，达到较长时间保胚的目的。由此可以看出，辣椒或者其他蔬菜高盐保胚时，借助于添加酸味剂等辅助措施，可降低食盐添加量，达到较长时间保存蔬菜原料目的的同时，减少蔬菜加工脱盐时资源浪费和环境污染。对比低盐发酵辣椒细菌多样性指数（待发表），X_G和M_G细菌的OTU值、ACE指数、Chaol指数和Simpson指数均远小于低盐发酵辣椒，说明盐渍辣椒的微生物多样性指数低于低盐发酵辣椒的微生物多样性指数，高盐抑制了大部分微生物生长，这也是盐渍辣椒利用高盐抑制大部分微生物生长，维持缓慢发酵，达到较长时间保胚的原因。

2.5 X_G和M_G细菌群落多样性分析

X_G和M_G微生物经454焦磷酸测序分析后得知，X_G已知分类的细菌可归属到8 个门、15 个纲、26 个目、31 个科、94 个属、101 个种，并检测到了13 个不能培养的细菌种。M_G已知分类的细菌可归属到6 个门、15 个纲、29 个目、44 个科、58 个属、42 个种，并检测到了10 种不能培养的细菌。

2.5.1 X_G和M_G在门水平细菌群落组成和相对丰度

图3 在门水平盐渍辣椒相对丰度大于0.01%细菌群落组成和相对丰度Fig.3 Relative abundances and phylum-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如图3所示，在门水平，X_G中相对丰度大于1%的细菌有蓝藻细菌（Cyanobacteria，77.01%）、变形菌门（Proteobacteria，14.78%）和厚壁菌门（Firmicutes，6.36%）；M_G中相对丰度大于1%的细菌有Proteobacteria（51.5%）和Firmicutes（46.92%）。X_G中检测出了大量Cyanobacteria，但在纲、目、科、属水平没有任何分类，推测Cyanobacteria实际上是宿主（辣椒）本身DNA的污染，M_G中未大批量检出Cyanobacteria的原因可能是米椒是整只盐渍，减少了辣椒切碎过程中辣椒汁的流出，从而降低了宿主DNA的污染[29]。因此，蔬菜中微生物DNA提取时，如何有效地去除宿主DNA的干扰是今后需要研究的课题。

2.5.2 X_G和M_G在纲水平细菌群落组成和相对丰度

图4 在纲水平盐渍辣椒相对丰度大于0.01%细菌群落组成和相对丰度Fig.4 Relative abundances and class-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如图4所示，在纲水平，X_G中相对丰度大于1%的已知分类细菌纲有叶绿体（chloroplast，77.01%）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，8.03%）、杆菌纲（Bacilli，6.3%）、α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria，6.15%）；M_G中相对丰度大于1%已知分类细菌纲有Gammaproteobacteria（49.36%）、梭菌纲（Clostridia，38.94%）、Bacilli（7.84%）、变形菌纲（Epsilonproteobacteria，1.9%）。由此可以看出，X_G和M_G在纲水平细菌群落组成相差不大，在纲水平，因叶绿体与细菌DNA的同源性而检测到了大量叶绿体，再次证明了X_G因切碎盐渍细菌DNA受宿主（辣椒）DNA的污染严重。

2.5.3 X_G和M_G在目水平细菌群落组成和相对丰度

如图5所示，在目水平，X_G中相对丰度大于1%的细菌有无分类地位目（77.01%）、乳杆菌目（Lactobacillales，6.15%）、肠杆菌目（Enterobacteriales，6%）、根瘤菌目（Rhizobiales，3.92%）、立克次体目（Rickettsiales，1.84%）和黄色单胞菌目（Xanthomonadales，1.41%）；M_G中相对丰度大于1%的细菌有海洋螺菌目（Oceanospirillales，48.82%）、盐厌氧菌目（Halanaerobiales，38.88%）、Lactobacillales（7.4%）和弯曲杆菌目（Campylobacterales，1.9%）。X_G和M_G在目水平细菌群落组成的差异较大，X_G中无分类地位目是宿主的DNA污染。

图5 在目水平盐渍辣椒相对丰度大于0.01%细菌群落组成和相对丰度Fig.5 Relative abundances and order-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.4 X_G和M_G在科水平细菌群落组成和相对丰度

如图6所示，在科水平，X_G中相对丰度大于1%的已知分类地位的细菌有肠杆菌科（Enterobacteriaceae，6%）、链球菌科（Streptococcaceae，5.22%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，2.78%）、线粒体（mitochondria，1.84%）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae，1.41%）；M_G中相对丰度大于1%的细菌有：盐厌氧菌科（Halanaerobiaceae，38.88%）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae，24.8%）、盐单胞菌科（Halomonadaceae，23.08%）、链球菌科（Streptococcaceae，5.31%）、肠球菌科（Enterococcaceae，1.93%）、弯曲杆菌科（Campylobacteraceae，1.9%）。

图6 在科水平盐渍辣椒相对丰度大于0.01%细菌群落组成和相对丰度Fig.6 Relative abundances and family-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.5 X_G和M_G在属水平细菌群落组成和相对丰度

如图7所示，X_G和M_G相对丰度大于0.01%的细菌分别有22 个属和19 个属，X_G中没有任何分类的细菌norank占78.89%，这就是线椒本身的叶绿体和线粒体基因，经去宿主DNA处理后，X_G和M_G相对丰度大于1%的细菌见图8，X_G和M_G相对丰度大于1%的细菌共有19 个属，分别是：盐厌氧菌（Halanaerobium）、海螺菌（Marinospirillum）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、色盐杆菌（Chromohalobacter）、盐单胞菌（Halomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、泛菌（Pantoea）、四联球菌（Tetragenococcus）、弓形菌（Arcobacter）、黄单胞菌（Xanthomonas）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas）、苍白杆菌（Ochrobactrum）、果胶杆菌（Pectobacterium）、漫游球菌（Vagococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas）、金黄色单胞菌（Aureimonas）、甲基杆菌（Methylobacterium）。通过对比发现：2 个样品的优势菌属的组成及相对丰度上存在较大差异，X_G的优势菌属为Lactococcus（24.51%）、根瘤菌（Rhizobium，13.17%）和未分类菌种（22.78%），共占60%以上；M_G的优势菌属为Halanaerobium（38.88%）、Marinospirillum（24.79%）、Chromohalobacter（12.32%）和Lactococcus（5.12%），共占80%以上。造成2 种盐渍辣椒优势菌属差异的原因可能跟原料的品种、含水量、辣椒素含量、发酵体系初始pH值等因素有关。2 种盐渍辣椒中丰度较高的乳酸菌仅为乳酸乳球菌，说明盐渍辣椒乳酸发酵比较微弱，发酵速度比较缓慢，能达到较长时间保胚的目的，且乳酸乳球菌是乳酸菌中耐盐性比较强的菌属[30]。

图7 在属水平盐渍辣椒细菌相对丰度大于0.01%群落组成和相对丰度Fig.7 Relative abundances and genus-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

图8 盐渍辣椒优势细菌相对丰度大于1%属群落组成和相对丰度Fig.8 Relative abundances and composition of dominant bacterial genera with relative abundance greater than 1% in salted peppers

图9 相对丰度前100的微生物OTU在样品间的分布Fig.9 OTU Distribution of top 100 most abundant microbial genera

从图9可以看出，经聚类分析后发现前100 个细菌OTU中，X_G中含有75 个，M_G中含有48 个，X_G和M_G中共同含有的细菌OTU有23 个，再次印证了X_G的细菌多样性大于M_G的细菌多样性的结论。

3 结 论

采用454焦磷酸测序技术对湖南坛坛香食品科技有限公司盐渍辣椒中两个主要品种X_G和M_G测序，X_G已知分类的细菌可归属到8 个门、15 个纲、26 个目、31 个科、94 个属、101 个种。M_G已知分类的细菌可归属到6 个门、15 个纲、29 个目、44 个科、58 个属、42 个种。X_G主要的细菌门有Cyanobacteria（77.01%）、Proteobacteria（14.78%）和Firmicutes（6.36%），M_G优势细菌门为Proteobacteria（51.5%）和Firmicute（46.92%）。X_G和M_G相对丰度大于1%的细菌属共有19 个，X_G中优势菌属为Lactococcus（24.51%）和Rhizobium（13.17%)。M_G中优势菌属为Halanaerobium（38.99%）、Marinospirillum（24.86%）、Chromohalobacter（12.36%）和Halomonas（9.67%）。测序结果表明，盐渍辣椒中存在着丰富的微生物资源，为发酵辣椒增香添味。同时本研究明晰了盐渍辣椒中的细菌群落组成及相对丰度，为盐渍辣椒优势优良菌种的筛选及发酵辣椒菌种资源库的建立提供了理论依据。