基于GC-MS结合化学计量学方法鉴别3 种江西名茶

徐春晖，王远兴

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶是江西省具有代表性的优质茶，色泽翠绿多毫，汤色清澈明亮，滋味鲜醇甘美，3 种茶叶的形状和香气特征非常相似，这使得它们很难通过传统形态学观察得到正确区分。目前，不同类型茶叶之间的鉴别仍取决于评茶师的感官评估，这种方法繁琐、耗时且受长期经验和主观判断所制约[1]。基于化学计量学的鉴别方法在短时间内能实现客观评价，以期在未来可部分甚至完全取代感官评价，这对茶叶产业的发展十分重要。

挥发性成分和非挥发性组分（如氨基酸、微量元素和儿茶素类等）构成了区分茶叶的物质组。其中，挥发性成分仅占茶叶干质量的0.01%左右，但其低阈值就能对气味产生高度敏感性，是决定茶叶品质的最重要因素之一。茶叶的挥发性成分取决于许多因素，例如生长地区、茶树品种、栽培技术、采摘时间、生产和加工方法等。为鉴别不同品质茶叶，通过一些化学计量学工具（如聚类分析、主成分分析和偏最小二乘-判别分析）对其挥发性物质进行分析[2]。使用聚类分析和主成分分析评价样本之间的差异，偏最小二乘-判别分析寻找样本之间的特征差异物质。聚类分析、主成分分析和偏最小二乘-判别分析在食品领域的产地溯源[3]、品质鉴别[4]、等级区分[5]、掺假鉴别[6]等方面应用广泛。LV Shidong等[7]结合顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对比分析普洱茶与茯砖茶的香气成分，采用聚类分析和主成分分析将2 种黑茶区分开，说明可根据挥发物以及相对含量的差异判别不同产地但形态特征相似的黑茶。然而，目前没有研究报道利用聚类分析、主成分分析及偏最小二乘-判别分析对狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶进行品质鉴别，并找出之间的特征性挥发物质。

GC-MS技术已广泛应用于植物挥发物的分离和鉴定。HS-SPME是一种优于传统萃取方式且高效、快速、无溶剂的新型挥发物萃取技术。该方法普遍用于提取各种类型食品的挥发性成分，例如蜂蜜[8]、啤酒[9]、葡萄[10]以及茶叶[11]等，体现出良好的重复性、灵敏性与选择性。

为鉴别狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶，本研究采用HS-SPME结合GC-MS对其挥发性化合物进行提取和分离鉴定。运用聚类分析、主成分分析比较三者挥发性物质的成分差异，以及偏最小二乘-判别分析找出三者之间的特征挥发性物质，以期为今后茶叶品质鉴别提供一种方便快速的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

庐山云雾茶（12 个批次）由九江市庐山茶科所茶场提供；狗牯脑（12 个批次）由遂川县汤湖镇遂川之宝生态农业开发有限公司提供；婺源绿茶（12 个批次）由婺源县婺康源有限公司提供。供试品均采于2019年5月，样品放置于4 ℃冰箱中保存。

正己烷（色谱级） 德国Merck公司；正构烷烃（C7～C30） 美国AccuStandard公司。

1.2 仪器与设备

7890 A气相色谱仪-7000三重串联四极杆质谱联用仪美国Agilent公司；57330-U SPME萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司；AL104电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME分析

将狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶磨成细粉，过40 目筛。准确称取2.00 g样品加入到20 mL顶空瓶中，加盖密封；然后立即放入80 ℃的恒温水浴锅中，平衡30 min，使顶空部分挥发物充分平衡；再将SPME萃取手柄穿透顶空瓶瓶盖，推出里面的纤维萃取头（首次使用此萃取头在270 ℃条件下老化30 min），将纤维萃取头暴露于样品顶部空间，萃取吸附30 min后，取出随即插入GC-MS进样口，250 ℃解吸5 min，使挥发性成分得到分离。

1.3.2 SPME参数优化设计

SPME条件优化技术参数主要有取样量、纤维萃取头、萃取温度、萃取时间与平衡时间等。本实验采用单因素试验，以庐山云雾茶LS-1用作不同条件下的优化样品，对SPME的2 个关键实验参数（萃取温度和萃取时间）进行优化。

1.3.3 GC-MS测定

GC条件：HP-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度≥99.999%）；柱流量1 mL/min（恒流模式）；分流比5∶1。升温程序：起始柱温50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至80 ℃，然后以2 ℃/min升至140 ℃，最后以5 ℃/min升至210 ℃保持5 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；离子化电压80 eV；四极杆温度150 ℃；全扫描模式；质量扫描范围m/z30～500；溶剂延迟时间2 min。

1.3.4 保留指数（retention index，RI）的测定

移取C7～C30正构烷烃混合标准品，用正己烷将其稀释至质量分数1%的溶液，以液体进样的形式，按照上述GC-MS条件进行分离，记录各组分的保留时间。

未知挥发性成分的RI按Kovats公式计算：

式中：RTx为待测挥发物的保留时间/min；n和n＋1分别为正构烷烃的碳原子数；RTn＜RTx＜RTn＋1。

1.4 数据处理

定性分析：由GC-MS采集的总离子流图中各吸收峰，可得到经质谱扫描得到的质谱数据，在NIST MS Search 2.0质谱检索数据库检索；将计算所得的RI与文献报道以及在线NIST数据库中查找的RI进行匹配，以上2 种方法共同确定各挥发性化合物的名称、分子式以及结构。

定量分析：在Agilent Masshunter定性分析软件中，采用峰面积归一化法，测出各挥发性物质的相对含量，结果以±s计。

多元统计分析：以各挥发性物质的相对含量为变量，用SIMCA 14.0版软件进行主成分分析和偏最小二乘-判别分析，用Heatmap Illustrator软件进行聚类分析。采用SPSS 25.0版软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）、独立样本t检验以及箱图的绘制，采用Origin 10.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME条件优化

图1 萃取时间（A）和萃取温度（B）对挥发性物质萃取效果的影响Fig.1 Effects of extraction time (A) and temperature (B) on extraction efficiency of volatile components

纤维萃取头需暴露在样品上方空间一段时间，以吸附分析物的挥发性化合物。萃取时间主要受萃取头类型、顶空体积、挥发性物质扩散系数、分散系数等因素影响。在萃取吸附未达到平衡之前，挥发性物质在萃取头上的吸附量随着时间延长而增加。待萃取吸附到达平衡时，才可将萃取头插入GC-MS进样口进行解吸。

在固定萃取温度80 ℃条件下，选取10、20、30 min和40 min的时间点，确定纤维涂层、顶空气相和分析物之间平衡所需的时间。由图1A可知，在30 min之前，随着萃取时间的延长，总峰面积和峰数目均升高，说明挥发性物质在纤维萃取头的吸附量增加。在30～40 min，总峰面积和峰数目变化不大，且在第40分钟时，总峰面积和峰数目略有降低，说明在第30分钟时，萃取头对挥发性物质的吸附量已饱和。综上述分析，确定最佳萃取时间为30 min。

当萃取温度升高时，较高的温度会加速挥发物从样品到顶部空间的扩散速度，有利于提高挥发性物质在纤维萃取头的吸附量，加快分析过程；同时，SPME是一个放热过程，高温可以降低分配系数，减少物质的萃取，使得在萃取头上的吸附量下降。因此，需要确定最佳萃取温度。

在最佳萃取时间30 min条件下，对60、70、80 ℃和90 ℃萃取温度进行考察，如图1B所示，挥发性物质的总峰面积和峰数目受温度影响较大。在60～70 ℃，总峰面积和峰数目略有升高，在70～80 ℃，总峰面积和峰数目大幅升高。而在80 ℃之后，90 ℃的总峰面积和峰数目均比80 ℃小。这可能是因为在温度较低的条件下，挥发性物质不能完全挥发出来，萃取头对挥发物吸附的量不多；随着温度的升高，挥发性物质逐渐挥发出来，使得萃取头上的吸附量大大增加；当温度进一步升高时，高沸点挥发性成分的竞争吸附使得一些低沸点挥发性成分不能被吸附，或吸附量很少[12]。综合上述分析，确定最佳萃取温度为80 ℃。

2.2 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶挥发性物质测定结果

表1 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶挥发性物质定性分析及相对含量Table 1 Qualitative analysis and relative contents of volatile components of Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

续表1

续表1

如表1、图2所示，采用的GC-MS条件可以较好分离3 种茶叶的挥发性成分。从3 种茶叶中鉴别出106 种挥发性物质，在狗牯脑中共含有92 种挥发性物质，包括13 种酯类（15.89%）、12 种酮类（9.46%）、22 种醇类（13.1%）、16 种烯烃类（11.55%）、6 种烷烃类（10.39%）、7 种醛类（3.32%）、3 种酚类（29.08%），其中咖啡碱（8.56%）、庚烷（6.68%）、丁酸叶醇酯（6.49%）、马鞭草烯酮（5.15%）、δ-杜松烯（3.64%）相对含量较高；在庐山云雾茶中共含有100 种挥发性物质，包括24 种醇类（22.56%）、14 种酯类（10.38%）、12 种酮类（11.45%）、17 种烯烃类（10.21%）、7 种烷烃类（7.89%）、6 种醛类（5.99%）、4 种酚类（24.33%），其中雪松醇（6.56%）、咖啡碱（6.07%）、β-紫罗酮（4.91%）、2-正戊基呋喃（3.35%）、壬醛（3.21%）相对含量较高；在婺源绿茶中共含有101 种挥发性物质，包括25 种醇类（30.33%）、14 种酯类（5.75%）、11 种酮类（3.84%）、22 种烯烃类（26.14%）、7 种烷烃类（7.41%）、7 种醛类（2.63%）、5 种酚类（18.35%），其中雪松烯（11.82%）、芳樟醇（10.07%）、香叶醇（6.90%）、δ-杜松烯（4.39%）、α-松油醇（2.11%）相对含量较高。3 种茶叶所鉴定出的挥发性物质含有醇类、酚类、酯类、酮类、醛类、碳氢化合物、杂环类和含氮化合物，其中醇类是最主要成分，其次是碳氢化合物，再次是酯类和酮类。3 种茶叶所鉴定出的挥发性化合物种类和相对含量差异明显，狗牯脑中酚类、酯类相对含量较高，庐山云雾茶中酚类、醇类和酮类相对含量较高，婺源绿茶中的醇类和烯烃类相对含量较高。

图2 狗牯脑（A）、庐山云雾茶（B）和婺源绿茶（C）挥发性物质总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of volatile components of Gougunao tea (A),Lu Mountain Cloud-Mist tea (B) and Wuyuan green tea (C)

2.3 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶的鉴别

2.3.1 主成分分析

表2 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶6 个主成分的特征值及其贡献率Table 2 Eigenvalues and cumulative contribution rates of 6 principal components in Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

利用SIMCA 14.0软件对狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶挥发性成分的相对含量进行主成分分析，由表2可知，前6 个成分的累计方差贡献率达到80%，说明该数据可代表所有的化学成分信息。R2X代表建模时，在X轴方向模型的解释率（即在X轴方向保留原始数据信息百分比的平方），当R2X越接近于1，说明原始数据信息保留越多；Q2代表模型的可预测能力，Q2大于0.5，说明该模型预测能力良好。本实验主成分分析模型，R2X为0.726，Q2为0.656，表明该模型可靠。

图3 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶主成分得分图（A）和载荷图（B）Fig.3 PCA score plot (A) and loading plot (B) of Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

从图3A可以看出，狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶分布在主成分空间中3 个相对独立的区域，基本得到了有效区分，说明3 种茶叶的挥发性成分在种类和相对含量上存在差异。图3B可反映引起3 种茶叶差异的关键变量。其中庚烷（3）、甲苯（4）、2,3-辛二酮（18）、3-蒈烯（29）、苯乙醇（36）、马鞭草烯酮（37）、凤梨醛（55）、可巴烯（66）、β-愈创木烯（81）、α-杜松醇（98）等挥发性物质在载荷图中的位置与狗牯脑在得分图中的位置类似，说明这些挥发性物质的含量在狗牯脑中较庐山云雾茶与婺源绿茶高，而4,4-二甲基-2-戊烯（6）、β-罗勒烯（22）、4-异丙基甲苯（24）、β-石竹烯（75）、3-甲基-十五烷（92）等挥发性物质在图3B中的位置与狗牯脑在图3A中的位置相反，说明这些挥发性物质的含量在狗牯脑中较庐山云雾茶与婺源绿茶低。1-五烯-3-醇（2）、3,5-二甲基苯酚（13）、橙花醚（39）、β-环柠檬醛（50）、茉莉内酯（59）、β-紫罗酮（83）、雪松醇（93）、植醇（106）等挥发性物质在图3B中的位置与庐山云雾茶在图3A中的位置类似，说明这些挥发性物质的含量在庐山云雾茶中较狗牯脑与婺源绿茶高，而α-荜澄茄油烯（62）、十四烷（73）、α-法尼烯（84）、δ-毕澄茄烯（86）、δ-杜松烯（88）、苯甲酸叶醇酯（99）等挥发性物质在图3B中的位置与庐山云雾茶在图3A中的位置相反，说明这些挥发性物质的含量在庐山云雾茶中较狗牯脑与婺源绿茶低。4-蒈烯（12）、芳樟醇（34）、α-萜品醇（45）、香叶醇（54）、α-广藿香烯（68）、β-榄香烯（70）等挥发性物质在图3B中的位置与婺源绿茶在图3A中的位置类似，说明这些挥发性物质的含量在婺源绿茶中较狗牯脑与庐山云雾茶高，苯甲醛（16）、桃金娘醇（28）、己酸叶醇酯（69）、叔十六硫醇（90）、十六烷（95）等挥发性物质在图3B中的位置与婺源绿茶在图3A中的位置相反，说明这些挥发性物质的含量在婺源绿茶中较狗牯脑与庐山云雾茶低。上述分析结果与表1数据一致。以上挥发性物质能作为该品质茶样的关键变量，可用于区分自身和其他2 个品质茶叶。

图4 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶的聚类热图Fig.4 Cluster heat maps of Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

2.3.2 聚类分析

由图4可知，狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶三者明显被区分开，这与主成分分析的结果相对应。狗牯脑与庐山云雾茶距离较近，距离婺源绿茶较远，说明狗牯脑与庐山云雾茶的挥发性成分相近，与婺源绿茶挥发性成分差异较大。在同一大类中，由于茶树品种、气候和加工制作方法等因素的不同又分成了不同小类，挥发性成分相近的茶叶在树状图中相距较近。在热图中，每一列代表一种挥发性物质，颜色从绿色到红色表示物质在样品中的含量由低到高，反映出各挥发性成分在不同样品中的含量差异。聚类热图既直观地显示了整个聚类过程，缩小了主观判断造成的误差，又客观反映挥发性成分在不同样品中的含量差异。

2.4 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶特征挥发性物质的确定

2.4.1 PLS-DA模型检验

采用SIMCA 14.0进行偏最小二乘-判别分析，以找到狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶之间的特征挥发性成分。使用有监督的偏最小二乘-判别分析时易产生过拟合现象，因此采用200 次响应的置换检验验证偏最小二乘-判别分析模型是否有过拟合现象。如图5A所示，置换检验得到的R2=0.022，Q2=－0.297，Q2于Y轴的截距是负值，说明此模型没有过拟合现象，模型预测能力好，可用于后续的特征挥发性物质的确定。

图5 PLS-DA模型的置换检验（A）和3 种茶的PLS-DA载荷图（B）Fig.5 PLS-DA permutation test (A) and model loading plot (B) of Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

图5B可反映每一个变量对已构建分析模型的贡献大小。其中，离中心原点和主要化合物团越远的变量说明其所代表的挥发性物质对已构建模型贡献越大。即离中心原点和主要化合物团越远的点，对狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶的差异判别贡献越大。从图5B可以看出，庚烷（3）、马鞭草烯酮（37）、二氢猕猴桃内酯（51）、丁酸叶醇酯（56）、2,6-二叔丁基对甲基苯酚（87）、咖啡碱（103）与狗牯脑距离更近，且远离中心原点和主要化合物团，对构建好的模型有显著贡献；同理，2-正戊基呋喃（20）、异胡薄荷醇（31）、壬醛（35）、β-紫罗酮（83）、橙花叔醇（91）、雪松醇（93）与庐山云雾茶距离相近，α-松油醇（32）、芳樟醇（34）、香叶醇（54）、雪松烯（74）、β-石竹烯（75）、δ-杜松烯（88）与婺源绿茶距离相近，且均远离中心原点和主要化合物团，对狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶的差异判别贡献大。其中，2,6-二叔丁基对甲基苯酚的主要用途是抗氧化剂，关于它的具体来源和贡献仍需进一步研究[31]，因其不是茶叶中固有的挥发性成分，故不参与特征性挥发物寻找的讨论。

2.4.2 变量权重重要性排序（variable importance for the projection，VIP）分析

如图6所示，总结每个变量对样品分类的贡献大小，通常认为VIP值大于1的变量是模型的重要代谢标志物。VIP值越大，说明该变量在判别过程中贡献越大，在样品之间的差异越显著。从图6可以看出，有24 个香气组分VIP值大于1.0，可作为区分狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶的重要代谢标志物。

2.4.3 特征挥发性物质的确定

图6 狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶的VIP图Fig.6 VIP analysis of Gougunao tea, Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

图7 特征挥发性物质在狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶中的相对含量Fig.7 Relative contents of characteristic volatile substances in Gougunao tea,Lu Mountain Cloud-Mist tea and Wuyuan green tea

采用SPSS 25.0版软件对以上远离原点和主要化合物团与VIP值大于1的变量进行单因素方差分析筛选特征挥发性物质，以P值小于0.01表示具有极显著差异的物质。综合分析，最终筛选结果确定20 个特征挥发性物质，即庚烷（3）、2-正戊基呋喃（20）、3-蒈烯（29）、异胡薄荷醇（31）、α-松油醇（32）、芳樟醇（34）、壬醛（35）、马鞭草烯酮（37）、β-环柠檬醛（50）、二氢猕猴桃内酯（51）、香叶醇（54）、凤梨醛（55）、丁酸叶醇酯（56）、雪松烯（74）、β-石竹烯（75）、β-紫罗酮（83）、δ-杜松烯（88）、5-戊基间苯二酚（89）、橙花叔醇（91）、雪松醇（93），其在狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶中的相对含量差异以箱图形式表示，结果见图7。

3 结 论

本实验通过HS-SPME-GC-MS技术对狗牯脑、庐山云雾茶和婺源绿茶的挥发性成分进行较为全面地鉴定，借助化学计量学方法对3 种不同品质的茶叶实现了准确客观评价，避免了繁琐复杂且受主观判断所制约的感官评价。寻找到3 种茶叶间的20 个特征挥发性成分，证实了一些重要化合物在狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶中含量上存在量的显著差异，这也是3 种茶叶具有各自独特香气特征的原因。

在已鉴定的20 个特征挥发性成分中，庚烷、3-蒈烯、马鞭草烯酮、二氢猕猴桃内酯、凤梨醛、丁酸叶醇酯、5-戊基间苯二酚对狗牯脑有更好的辨别能力，可作为狗牯脑的特征性组分。庚烷属于饱和烃，饱和烃无太多香气气息，不饱和烃则对茶叶香气有重要贡献，3-蒈烯属于单萜烯类，具有强烈的松木样香气。马鞭草烯酮是存在于茶叶中天然物质，具有类似樟脑、薄荷脑、芹菜香气。二氢猕猴桃内酯是茶叶中常见的内酯，具有甜香、果香微带奶香气息。丁酸叶醇酯具有水果和玫瑰花香味。5-戊基间苯二酚是一种天然多酚类化合物，凤梨醛具有菠萝香味。2-正戊基呋喃、异胡薄荷醇、壬醛、β-环柠檬醛、β-紫罗酮、橙花叔醇、雪松醇可作为庐山云雾茶的特征挥发性成分。2-正戊基呋喃具有焦糖香气。异胡薄荷醇具有樟脑和薄荷香气，同时带有玫瑰叶和香茅香韵。醛类产生途径较复杂，例如脂肪酸的过氧化及降解等产生，氨基酸脱羧和氧化脱氨产生，或者是醇类化合物的性质不稳定，易被氧化成醛等。壬醛具有青草香、脂香香气，赋予绿茶青香气息，β-环柠檬醛具有凉香、果香和清香气息。β-紫罗酮具有甘甜而醇厚的花香气息，且微带木香气息，其产生机理为儿茶素发生酶促氧化引起的β-胡萝卜素等氧化，降解为β-紫罗酮及相关结构的香气化合物[32]。橙花叔醇呈玫瑰及苹果香气，雪松醇带有弱木香味。婺源绿茶与α-松油醇、芳樟醇、香叶醇、雪松烯、β-石竹烯、δ-杜松烯的含量显著相关，可作为婺源绿茶的特征性成分。α-松油醇有类似紫丁香的气味。在以往研究中，芳樟醇、香叶醇是绿茶挥发性成分中的关键呈香成分，芳樟醇表现出花香、木香和类似薰衣草的香气特征；香叶醇带有蔷薇香，其含量与茶树的品种、加工方法、鲜叶老嫩有关[31]。雪松烯具有柏木香味，β-石竹烯具有淡的丁香香味，δ-杜松烯具有温和木香气息。

HS-SPME-GC-MS结合化学计量学方法能够实现对狗牯脑、庐山云雾茶与婺源绿茶的准确区分，并能够筛选出其中的特征挥发性物质。该方法比传统的感官评价方法更客观、高效、准确，为茶叶的质量鉴别与品质控制提供了有效的检测方法。