芽孢杆菌对发酵大豆产生氨基酸和挥发性香气成分的影响

张 妍，武俊瑞，曹承旭，邱博书，马 颖，史海粟，杨 慧，乌日娜

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

传统发酵豆酱是风味独特且营养价值丰富的发酵大豆类制品[1]。豆酱的风味和品质与其中发酵微生物密切相关[2]，利用对发酵有影响的优势微生物直接接种发酵，可在不损失营养风味的前提下快速缩短豆酱发酵周期，对优化豆酱发酵品质具有十分重要的意义[3]。

现有研究报道豆酱发酵过程中主要微生物类群有霉菌、酵母菌和细菌[4-5]，Zhang Pengfei等[6]检测到豆酱酱醅优势细菌中含有芽孢杆菌。实验室前期通过宏基因组学研究表明芽孢杆菌与氨基酸形成及香气物质产生具有一定关系[7-8]，且不同类别及不同含量的氨基酸对豆酱风味物质形成具有一定影响[9]。乌日娜等[10]发现芽孢杆菌可协助真菌分解大豆中的蛋白质和淀粉。续丹丹等[11]认为芽孢杆菌基本贯穿整个豆酱发酵过程[12]，参与物质的分解代谢[13]。Kim等[14]认为中国豆酱中芽孢杆菌为优势菌；Gao Xianli等[15]研究表明芽孢杆菌为发酵过程中的优势菌群；Lee等[16]通过一系列分析认为脂肪酸代谢与芽孢杆菌密切相关。

本研究以传统发酵豆酱中筛选出的具有较强产酶能力的芽孢杆菌作实验菌，探究芽孢杆菌对大豆发酵过程氨基酸和挥发性香气成分的影响。通过大豆模拟发酵实验、游离氨基酸检测[17]、顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）[18]和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19]对芽孢杆菌发酵大豆样品所产氨基酸和风味物质进行研究，经因子分析[20]，进一步明确芽孢杆菌对大豆发酵样品香气成分具有的贡献，对优化发酵条件、提高发酵豆酱品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芽孢杆菌为本实验室前期从黑龙江佳木斯、大庆、齐齐哈尔和辽宁朝阳地区传统自然发酵豆酱中分离筛选所得9 株益生特性、产酶特性良好的菌株，编号为：JMS1-1、JMS1-3、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3、QQHE-2、QQHE-3、CY-1、CY-3。经鉴定分别为枯草芽孢杆菌6 株、地衣芽孢杆菌1 株和解淀粉芽孢杆菌2 株，保藏于实验室菌种库。

LB培养基：NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.2～7.4。

三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）、茚三酮、氨基酸混合标样 德国Sykam公司；NaCl、胰蛋白胨、酵母浸粉、盐酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

L-8800全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；6890N-5973型GC-MS联用仪 安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢杆菌发酵大豆样品中游离氨基酸分析1.3.1.1 样品的制备

参考胡美忠等[21]方法对芽孢杆菌进行活化，种子液按2%比例接种于LB培养基中。蒸馏水泡发1 d的豆子，去皮，取100 g处理好的豆子和5 mL蒸馏水于250 mL锥形瓶中，灭菌。以3%接种量将二代芽孢杆菌分别接种于已高温灭菌的大豆中，做好标记，37 ℃下每12 h扣瓶1 次，固态发酵5 d[22]。

1.3.1.2 样品前处理

参考张苗等[23]TCA沉淀法和双缩脲比色法对发酵样品进行测定。定容后的样品于47 ℃超声提取1 h，并以1 700 r/min离心30 min。取2 mL上清液至蒸发皿中蒸干，向其中加入0.02 mol/L盐酸溶液2.5 mL，充分溶解后过滤，收集的液体即可作为待测液进行上机测定。

1.3.1.3 氨基酸含量计算

式中：Xi为样品中游离氨基酸含量/（mg/g）；Ci为游离氨基酸检测量/（nmol/mL）；F为稀释倍数；V为体积/mL；M为氨基酸分子质量/（g/mol）；m为样品质量/g。

1.3.2 芽孢杆菌发酵大豆样品中挥发性风味物质分析

1.3.2.1 发酵样品挥发性风味化合物萃取

称取每种芽孢杆菌发酵大豆样品5 g充分研磨至10 mL顶空瓶底部。对萃取针头进行老化，以确保除去可能吸附的挥发性成分，将老化好的萃取针头插入顶空瓶中，通过手柄推出石英纤维头，使其暴露在顶空瓶顶空气体中，将顶空瓶放入恒温60 ℃水浴中萃取30 min。用手柄将石英纤维头推回针头内并拔出，然后插入GC-MS仪进样器中，同时启动仪器收集数据。

1.3.2.2 GC-MS分析条件

色谱条件：DB-5MS[24]弹性毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。进样口温度250 ℃，载气He，流速1.0 mL/min。由室温升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，降温至80 ℃，不分流进样。

质谱条件：离子源在225 ℃全扫描，电离方式为电子电离源，电子能量70 eV；扫描质量范围m/z33～450。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010、Xcalibur和SPSS 17.0软件系统对发酵样品中各挥发性风味物质数据进行分析，采用面积归一化法对检测出的化合物相对含量进行确定。

2 结果与分析

2.1 发酵大豆样品中游离氨基酸分析

以高温灭菌未接种芽孢杆菌且发酵5 d的大豆作为空白大豆对照组；以传统工艺发酵成熟豆酱样品作为发酵成熟豆酱对照组。分别对9 份接种芽孢杆菌大豆发酵样品和2 份对照组样品进行检测，结果如表1所示。

表1 发酵大豆样品中各游离氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents in fermented soybeans

从表1可以看出，在芽孢杆菌发酵大豆样品中共检测出17 种游离氨基酸，不同菌株发酵样品间含量差异较大。总游离氨基酸含量由高到低依次为JMS1-1＞JMS2-5＞DQ1-1＞DQ1-3＞QQHE-3＞JMS1-3＞QQHE-2＞CY1＞CY3，JMS1-1发酵样品游离总氨基酸含量为12.98 mg/g，明显高于其他8 株发酵样品，是空白大豆对照组的8 倍，是传统发酵成熟豆酱对照组的42.53%。发酵样品中检测出的天冬氨酸和谷氨酸是豆酱形成鲜味的主要氨基酸，发酵样品鲜味氨基酸平均值占发酵成熟豆酱样品23.95%；苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸是形成甜味的主要氨基酸；组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸是具有微苦的物质，苦味形成相关氨基酸所占比重最大，平均值是发酵成熟豆酱对照组的40.92%；赖氨酸、脯氨酸和半胱氨酸为非呈味氨基酸。由表1可知，芽孢杆菌发酵大豆样品中，产生苦味和无味氨基酸比重大，鲜味氨基酸其次，甜味氨基酸最少。由于必需氨基酸对人体至关重要，对表1数据进行整理发现，9 份样品必需氨基酸平均值为2.48 mg/g，是发酵成熟豆酱对照组的31.55%，所占比值较大，推断芽孢杆菌发酵大豆样品可产生较多的必需氨基酸，提升豆酱的营养价值。其中JMS1-1发酵样品必需氨基酸含量最高，为5.23 mg/g，是发酵成熟豆酱对照组的66.54%。

表2 发酵组和空白大豆对照组方差分析Table 2 Analysis of variance for fermented and unfermented soybeans

对上述所得发酵组与空白组数据进行显著差异分析，结果如表2所示。F=31.351 57＞F0.01（1,78），说明芽孢杆菌发酵样品相对于空白大豆发酵样品所产生氨基酸差异极显著。

综合上述结果，得出5 株芽孢杆菌在大豆发酵过程中对氨基酸形成起促进作用的优势菌株，分别为枯草芽孢杆菌JMS1-1、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3菌株和地衣芽孢杆菌QQHE-3菌株，进一步对其挥发性成分种类含量进行测定。

2.2 发酵大豆样品中挥发性风味物质成分分析

采用HS-SPME-GC-MS对上述5 株芽孢杆菌发酵样品挥发性香气成分进行分析，得到总离子流色谱图如图1所示。

图1 芽孢杆菌产风味物质离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of flavor substances produced by Bacillus

由图1可看出，5 株芽孢杆菌发酵样品产物的色谱图极为相似，发酵产物的出峰时间和峰的强度一致，说明5 株芽孢杆菌产物大致相同。将所得总离子流色谱图，经质谱检索分析后，得出挥发性风味物质及相对含量，如表3所示。

表3 芽孢杆菌发酵产物中鉴定出的挥发性风味物质及相对含量Table 3 Volatile flavor substances and their relative contents identified in Bacillus fermented soybeans%

续表3

由表3可知，不同芽孢杆菌发酵样品所产挥发性风味物质含量和组成不同，相对含量由22.34%～75.77%不等。在5 株芽孢杆菌发酵大豆样品中共检测出71 种香气成分，包含10 种酯类、13 种醇类、6 种醛类、11 种烷类、8 种酸类、5 种酮类和18 种其他类化合物。

5 份发酵样品中，酯类物质[25]含量最多的为JMS2-5和DQ1-1，物质相对含量为10.34%和18.85%，醇类物质相对含量为21.37%、48.64%、40.52%、5.9%和12.35%。酯、醇类化合物是豆酱发酵过程中重要的香气成分，5 份样品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有检出，但含量各不相同。

5 份发酵样品中，酮类物质是醛类形成的前体物质，醛可被还原生成醇和酯等化合物[26]。QQHE-3产醛类物质含量最多，相对含量为7.50%；DQ1-1产酮类物质较多，相对含量为8.06%。在5 株芽孢杆菌发酵样品中均有检出的烷类化合物分别为六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷，DQ1-3菌株发酵样品中含量最高的烷类化合物，相对含量分为36.12%。庞惟俏等[27]认为发酵过程产生的烷烃类化合物可能是微生物的代谢产物，或大豆原料中含有的物质。苯酚类化合物在4 株发酵样品中均被检测出，其中JMS2-5菌株所产相对含量相比于其他菌株含量较高，含氮类化合物2-正戊基呋喃在4 株发酵样品中均被检测且相对含量较高，苗志伟等[28]认为这种物质为常见的传统豆酱香气成分。愈创木酚作为豆酱中常见的香气物质，在JMS2-5、DQ1-1和DQ1-3中均有检出。综上所述，5 株芽孢杆菌发酵大豆样品所产挥发性香气成分具有差异，但有利于豆酱风味物质的形成。

2.3 发酵大豆样品产生的香气成分因子分析

2.3.1 KMO和Bartlett球形检验

为确定不同菌株发酵大豆所产生的挥发性香气成分数据是否适宜进行因子分析，首先对KMO和Bartlett球形检验进行分析，如表4所示。KMO值为0.760，数值在0.5～1之间且接近于1，表明变量间的相关性较大。Bartlett球形检验，P=0.000＜0.005，说明数据满足正态总体分布。因此，芽孢杆菌发酵大豆所产生的挥发性香气成分数据可进行因子分析。

表4 KMO和Bartlett球形检验Table 4 KMO and Bartlett test

2.3.2 芽孢杆菌发酵大豆香气成分因子分析

用SPSS软件对数据进行因子分析，由表5可知，前2个因子不旋转时因子贡献率分别为54.857%和29.929%，累计贡献率达到84.786%＞80%，特征值分别为3.840和2.095均大于1，说明这2 个因子包含7 类香气成分信息[20]，因此，提取2 个公因子较为合适。

表5 优势菌接种大豆酱香气成分的特征值和方差贡献率Table 5 Eigenvalues and variance contributions of aroma components of Bacillus fermented soybeans

由于因子意义不明，本研究采用方差正交旋转因子模型法，对初始因子进行旋转，得到因子载荷矩阵和因子得分系数矩阵（表6）。由旋转后的因子载荷矩阵可以看出，第1公因子酯类（X1）、醇类（X2）、醛类（X3）和烷类（X4）载荷较大，说明这4 类化合物具有较强相关性，也表示芽孢杆菌发酵大豆样品所产生的香气成分，酯、醇和醛3 种物质为芽孢杆菌发酵大豆样品中主要香气成分。第2公因子酸类（X5）、酮类（X6）和其他类（X7）载荷较大，这几类在发酵过程中比重较小，但可起自身独特作用丰富豆酱风味。根据旋转后因子得分系数矩阵，建立因子得分模型F1、F2。

表6 旋转后的载荷矩阵和因子得分系数矩阵Table 6 Loading and component score coefficient matrix after rotation

2.3.3 芽孢杆菌发酵大豆香气成分综合评价

单独使用因子F1或因子F2并不能对芽孢杆菌发酵大豆香气成分作出综合评价，因此，按各公因子对应的方差贡献率为权数计算综合统计量为：F=0.544 72F1＋0.303 14F2。

最后根据所求F值对不同芽孢杆菌发酵的大豆进行排序，见表7。不同芽孢杆菌发酵的大豆所产香气因子分析排序为：DQ1-1＞JMS2-5＞DQ1-3＞JMS1-1＞QQHE-3。

表7 因子综合得分Table 7 Synthetic factor scores of Bacillus fermented soybeans

3 讨 论

芽孢杆菌具有很强的分解能力，它可以在增殖的同时，释放出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等，这些可将大分子物质分解成有利用价值的小分子物质[29]。经芽孢杆菌发酵的大豆样品中游离氨基酸含量明显升高，9 份发酵样品总游离氨基酸平均值比空白大豆对照组高出4 倍以上，推测芽孢杆菌的添加通过酶的效果可以使大豆蛋白质分解并转化为游离氨基酸。芽孢杆菌发酵样品产生挥发性风味物质成分较多，其中，酯、醇类化合物含量较高，检测到存在十六烷酸甲酯，有研究表明这种酯类物质对豆酱风味稳定性具有贡献[27]。发酵样品中检测出的3-羟基-2-丁酮物质，有报道表明在豆酱、酱油以及日本味增等发酵产品中被检出过，且为一种常见的风味物质[30]。产生的苯酚和愈创木酚等物质是豆酱风味形成中常见的香气物质。5 份芽孢杆菌发酵样品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有检出，推测这2 种物质与芽孢杆菌发酵的大豆样品具有一定相关性。因此，推断芽孢杆菌对大豆发酵过程游离氨基酸及风味物质的形成具有影响。

从总游离氨基酸含量可以看出，9 份发酵样品游离氨基酸含量不同，推测不同芽孢杆菌分解产生游离氨基酸量的能力存在差异。发酵样品产生呈味氨基酸差异较大，苦味氨基酸含量高于其他呈味氨基酸含量。在成熟豆酱对照组中甜味氨基酸含量较多，因此，推测在发酵后期甜味氨基酸形成较多。发酵样品中异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，这3 种必需氨基酸含量平均值大于发酵成熟豆酱对照组，推断芽孢杆菌发酵大豆样品可产生较多的必需氨基酸，提升豆酱的营养价值。5 份芽孢杆菌发酵样品挥发性风味物质相对含量差异较大，推测不同菌株产香气能力存在较大差异，发现4 份发酵样品产醇类化合物最多，而QQHE-3发酵样品产醛类化合物最多。芽孢杆菌的添加可产生不同种类含量化合物，这些化合物共同作用使整体香气协调，这与张鹏飞等[1]认为传统发酵豆酱中酯、醇、醛、酸、酮等物质是豆酱香气形成的主要成分观点一致。

4 结 论

综上所述，采用氨基酸自动分析仪、GC-MS联用仪对芽孢杆菌发酵的大豆样品中游离氨基酸和挥发性风味成分进行测定，共检测出17 种游离氨基酸和71 种挥发性香气成分。然而，不同芽孢杆菌菌株间存在个体差异，JMS1-1菌株发酵样品产总游离氨基酸和必需氨基酸含量最多，分别是发酵成熟豆酱对照组的42.53%和66.54%，DQ1-1菌株发酵样品产香综合因子得分最高。各发酵样品中均有乙酸己酯和1-辛烯-3-醇检出，而豆酱风味形成常见的香气物质苯酚和愈创木酚也被检出。因此，推断芽孢杆菌对大豆发酵过程游离氨基酸及风味物质的形成均发挥着重要的作用。进一步因子分析，认为酯、醇和醛3 类物质为芽孢杆菌发酵大豆样品中主要香气成分，这可为生产加工具有良好风味的发酵豆制品，提供参考。