上海市食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子特征及耐药性

张鹏飞，张 杰，刘心雨，付雪婷，张 萌，许学斌，吴聪明，姬 华，王 新,

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.上海市疾病预防控制中心微生物实验室，上海 200336；3.中国农业大学动物医学院，北京 100193；4.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，容易造成人食物中毒和感染。其适应性强、分布范围广，可广泛存在于自然界的空气、土壤和水中，也经常出现在人和动物的皮肤和黏膜[1]。研究表明，20%的人群是金黄色葡萄球菌的持续携带者，而30%左右的人群是间歇性携带者[2]，说明金黄色葡萄球菌也可通过食品操作者这一途径污染食物。值得注意的是，除感染外，金黄色葡萄球菌还与毒素介导的食物中毒有关。人们食用被金黄色葡萄球菌污染的食品而引起严重的毒素介导的食物中毒，主要症状包括呕吐、腹部绞痛和腹泻，严重时还会出现头痛，肌肉痉挛、休克等[3]。金黄色葡萄球菌分泌的毒素主要有肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、溶血素（hemolysin）、剥脱毒素（exfoliative toxins，Ets）、中毒休克毒素-1（toxic-shock syndrome toxin-1，Tsst-1）和杀白细胞素（paton-valentine leukocidin，PVL）等[4-7]。其中SEs是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子[4,8]。到目前为止，SEs种类有23 种，除SEA～SEE五种经典肠毒素外，近年来还发现了SEG-SELX等新型肠毒素，引发食物中毒的菌株主要表达经典肠毒素[4,8]。

近年来，随着抗生素在医院治疗和动物养殖中的大量使用，病原体在抗生素选择压力下不断进化，导致新的致病菌的出现和传播，其中就包括“超级耐药细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantS.aureus，MRSA）[9]。由于MRSA菌株的超耐药性，很快在医院、社区和动物中流行，目前已经成为一个重大的公共卫生问题。值得注意的是，MRSA已存在于多种食物中，尤其是食用动物及其产品[10-13]。研究表明，屠宰携带MRSA的动物以及感染MRSA的人员处理食品时都会造成食物的污染[14-16]。这些耐药细菌可通过各种途径从食品来源转移到人类，假如食物可作为人感染MRSA的重要储库和来源，这将对人类健康造成巨大威胁。

葡萄球菌染色体基因盒mec（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型、葡萄球菌A蛋白（Staphylococcusprotein A，spa）分型和多位点序列（multilocus sequence typing，MLST）分型是S.aureus的3 种常用分型方法。mec基因位于可移动元件SCCmec上，且不同的MRSA菌株的SCCmec型别存在较大差异。目前有12 种分型被发现（I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI和XII型）[17]。如医院感染MRSA（hospital-associated MRSA，HA-MRSA）菌株多为I型、II型和III型，由于其除携带mecA基因外还带有其他耐药基因，因此该类型MRSA普遍具有多重耐药特点；而社区获得性MRSA（community-associated MRSA，CA-MRSA）菌株多为IV型、V型和VII型和动物源MRSA（livestockassociated MRSA，LA-MRSA）多为IV和V型[17]。综合spa、MLST和SCCmec分型发现，LA-MRSA的主要型别为ST398-IV/V-t011/t034和ST9-IV/V-t899，其中ST398-IV/V-t011/t034分子型主要分布于欧洲和北美洲和ST9-IV/V-t899分子型主要分布于亚洲；HA-MRSA的主要型别为ST5-II-t002和ST239-III-t030/t037；CA-MRSA的主要型别为ST1-IV-t127和ST59-IV/V-t437[18]。因此SCCmec分型、spa分型和MLST分型既可作为探讨MRSA在人-畜-食品传播途径的重要依据，也是MRSA进行流行病学调查研究的重要工具。

本研究以上海市连续6 a分离到的食源性金黄色葡萄球菌为研究对象，了解上海市MRSA在不同种类食品中的流行情况以及菌株的耐药性和分子特征。进而判断MRSA易污染的食品以及可能的污染源，旨在为有效预防MRSA在食品中的污染，也为临床治疗时科学、合理地选用抗菌药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株来自上海市疾病预防控制中心2011—2016年分离到的184 株食源性金黄色葡萄球菌。其中，4 株来源于鸡蛋，2 株来源于焙烤食品，11 株来源于海鲜，16 株来源于凉拌菜，121 株来源于生肉制品，11 株来源于熟肉制品，4 株来源于熟制米面制品和15 株食源性金黄色葡萄球菌来源暂不清楚。全部菌株通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对耐热核酸酶基因（nuc）扩增鉴定为金黄色葡萄球菌。此外，耐药性质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922。所有的菌株贮存在－80 ℃冰箱直至使用。

Mueller Hinton（MH）琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB） 北京陆桥技术有限责任公司；抗生素北京索莱宝科技有限公司；溶葡萄球菌素 美国Sigma公司；Taq酶、Buffer（Mg2＋）、dNTP、MgCl2大连宝生物（TaKaRa）公司；DNA提取试剂盒 杭州博日科技有限公司；引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

将冻存管菌株活化在TSA平板上，37 ℃培养24 h。挑取单菌落于5 mL的TSB培养基，放置摇床37 ℃、220 r/min培养12 h。然后根据Biospin细菌DNA抽提试剂盒说明书进行操作。最后将抽提的细菌基因组DNA模板放置在－40 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 MRSA菌株鉴定

参考Wang Xin等[10]的方法，采用PCR方法对金黄色葡萄球菌DNA模板进行mecA基因扩增，检测为mecA阳性的菌株，即为MRSA菌株。

1.2.3 耐药性检测

根据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）推荐的琼脂稀释法对食源性MRSA菌株进行15 种常用抗生素的最低抑菌浓度测定，具体药物为青霉素（penicillin，PEN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、苯唑西林（oxacillin，OXA）、红霉素（erythromycin，ERY）、四环素（tetracyclines，TET）、头孢西丁（cefoxitin，FOX）、头孢哌酮（cefoperazone，FOP）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、庆大霉素（chloramphenicol，GEN）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampin，RIF）、万古霉素（vancomycin，VAN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S）、阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C）。用药最低抑菌浓度见表1。

表1 药敏测定抗生素及耐药折点Table 1Drug-resistance breakpoints of antibiotics tested in this study

1.2.4 毒素基因检测

参考Wang Xin等[10]的方法，采用PCR方法对所有的食源性MRSA菌株进行27 种毒素基因检测，包括5 种经典肠毒素基因（sea、seb、sec、sed和see），16 种新型肠毒素基因（seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、ses、set、seu和sev），4 种溶血素基因（hla、hlb、hld和hlg），杀白细胞毒素基因（pvl），中毒休克综合征毒素基因（tsst-1）。

1.2.5 分子分型

1.2.5.1 spa分型

spa分型是根据金黄色葡萄球菌蛋白A的X区存在可变的24 bp重复序列建立的基因分型方法。参照spa分型数据库网站（https://www.spaserver.ridom.de/）推荐的方法进行引物设计和PCR扩增，首先运用PCR方法对spa基因进行扩增和测序。将测序结果提交到该网站，获得菌株的spa型别。spa基因扩增和测序引物从该网站获得：spa-1113f（5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’）、spa-1514r（5’-CAGTAGTG CCGTTTGCTT-3’），并由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.5.2 MLST分型

参照MLST数据库网站（http://www.mlst.net/）推荐的方法进行引物设计和PCR扩增。首先通过PCR方法对7 个管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）进行扩增和测序。将测序结果上传到该网站进行比对，获取具体ST型别。

1.2.5.3 SCCmec分型

参照Zhang Kunyan等[19]的方法，采用多重PCR法测定SCCmec的类型，并将PCR产物于1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，根据扩增条带大小判断MRSA菌株的SCCmec型别。

1.3 数据统计及图表绘制

按CLSI 2014标准进行耐药性判断，所有数据采用Excel 2016软件进行数据统计分析并运用Word 2003进行三线表的绘制。

2 结果与分析

2.1 MRSA检出情况

运用PCR方法对184 株食源性金黄色葡萄球菌进行mecA基因检测，共检测到9 株mecA阳性菌株，检出率为4.9%（9/184）（表2）。其中，1 株来源于鸡蛋样本，占该样本菌株的25.0%（1/4）；1 株来源于凉拌菜样本，占该样本菌株的6.3%（1/16）；3 株来源于生肉制品，占该样本菌株的2.6%（3/115）；4 株来源于熟肉制品，占该样本菌株的23.5%（4/17）。说明MRSA菌株主要污染食源性动物制品和手工食品。

表2 MRSA分离情况Table 2 Isolation of MRSA

2.2 MRSA菌株耐药情况

表3 MRSA菌株的耐药性及分子特性Table 3 Antimicrobial susceptibility and molecular characteristics of MRSA isolates

如表3所示，所有的MRSA菌株都表现为多重耐药，至少耐受3 种不同类型的抗生素。其中，对AMP和PEN的耐药最为普遍，耐药率达100.0%（9/9），其次对FOX和T/S的耐药率为88.9%（8/9），对ERY耐药率为55.6%（5/9），对A/C耐药率为33.3%（3/9），对TET和OXA的耐药率为22.2%（2/9）和对CIP的耐药率为11.1%（1/9）。所有MRSA菌株均对FOP、CHL、RIF、VAN、AMK和GEN敏感。在本研究中9 株MRSA菌株共有8 种不同的耐药谱，其中最常见的耐药谱是AMP-FOX-T/S-PEN，检出率为22.2%（2/9）。

2.3 分子分型

2.3.1 spa分型

对9 株MRSA菌株进行spa基因扩增，测序并进行数据比对分析，结果如表3所示。所有的MRSA菌株共有6 种分型。其中主导的spa型为t437 33.3%（3/9），其次为t14340 22.2%（2/9），t002、t034、t4549和t10738均为11.1%（1/9）。

2.3.2 MLST分型

对9 株MRSA菌株的7 个管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）进行扩增，测序并进行数据比对分析，结果如表3所示。所有的MRSA菌株共有6 种ST型，其中检出最高的为ST59 33.3%（3/9），其次为ST88 22.2%（2/9），ST4495、ST630、ST398和ST5均为11.1%（1/9）。

2.3.3 SCCmec分型

为了进一步了解MRSA菌株的分子流行病学，对所有的MRSA菌株进行SCCmec分型，结果如表3所示。9 株MRSA菌株共有8 株菌被分型，共有3 种分型，分别为II、III和IVa型。其中检出最高的为IVa型44.4%（4/9），其次为III型33.3%（3/9）和II型11.1%（1/9）。

2.4 MRSA菌株毒素基因携带情况

表4 毒素基因检出结果Table 4 Results of detection of enterotoxin genes

对27 种毒素基因进行检测，结果如表4所示，所有菌株至少携带1 种毒素基因，包括seb、seg、sei、sem、sen、seo、sep、seq、hla、hlb、hld和pvl基因。其中2 个溶血素基因（hla和hld）和杀白细胞素基因（pvl）的携带率最高为100.0%（9/9），其次为hlb66.7%（6/9），seg33.3%（3/9），sep和seq均为22.2%（2/9），seb、sei、sem、sen和seo均为11.1%（1/9），此外13 个肠毒素基因（sea、sec、sed、see、seh、sej、sek、sel、ser、ses、set、seu和sev），溶血素hlg基因和中毒休克综合征毒素基因（tsst-1）没有检出。从27 种毒素基因的携带情况看，菌株携带杀白细胞素基因（pvl）和溶血素基因的比率较高，所占比例分别为20.0%（9/45）和53.3%（9/45）。在本研究中9 株MRSA菌株共有7 种不同的毒素基因谱，每株菌株携带4～8 种毒素基因不等，其中最常见的基因谱sep-hla-hlb-hld-pvl和hla-hlb-hld-pvl均为22.2%（2/9）。

3 讨 论

近年来，由于MRSA不仅对β-内酰胺类抗生素耐药，同时还对非β-内酰胺类抗生素表现耐受，迅速成为污染食品的病原菌之一[20-21]。但目前，对同一地区不同种类的食品，进行连续多年的跟踪调查鲜有报道。在本研究中，食源性MRSA的分离率较低（4.9%，9/184），其中MRSA主要分离自熟肉制品（44.4%，4/9）和生肉制品（33.3%，3/9），其次为鸡蛋和凉拌菜（均为11.1%，1/9），而在糕点、海鲜和熟制米面制品中均无检出。该结果与Weese[11]、Wang Xin[12]和Normanno[22]等报道的食源性动物产品及其制品中MRSA的污染率比较一致，表明国内外食源性MRSA均处于较低水平的流行。但也不排除由于食源性动物产品及其制品样本较大，造成MRSA菌株检出较多的可能。在中国，人们更倾向食用加热处理后的食品，众所周知对食品进行加热处理可以杀死其中的细菌，但本研究在熟肉制品MRSA的检出率最高，说明动物产品及其制品是MRSA传播到人的一个主要储库。

在本研究中，所有的MRSA菌株都表现为多重耐药，都至少耐受3 种抗生素。该结果较Wang Xin[10]和Fessler[13]等报道的食源性MRSA菌株的耐药性弱一些。在本研究中，食源性MRSA菌株除对ERY和T/S抗生素耐受外，对非β-内酰胺类抗菌药物几乎都不耐受，造成这一结果的原因可能是由于不同地区抗生素的使用情况存在差异，导致不同耐药表型菌株的出现[23]。本研究所有的食源性MRSA菌株均对VAN敏感，说明糖肽类抗生素仍然是治疗MRSA最有效的药物。值得注意的是，在本研究中存在较多的食源性MRSA菌株（77.8%，7/9）对OXA敏感而对FOX耐药。这与其他研究报道[24-26]一致，在医院和食品中也分离到OXA敏感而对FOX耐药的MRSA菌株。现已将OXA敏感-FOX耐药-mecA阳性的金黄色葡萄球菌定义为OS-MRSA菌株（oxacillin-susceptiblemecA-positiveS.aureus，OS-MRSA）[27]。最近有文献报道[27]，在OS-MRSA菌株中，mecA基因的表达受bla系统（blaI-blaR1-blaZ）调控，bla系统的缺失或者突变会影响mecA基因的表达，从而影响MRSA菌株的耐药表型。因此，只通过菌株耐药表型定义MRSA，很容易造成MRSA菌株的漏检。由于mecA基因的存在，在抗生素的压力下易引发超耐药MRSA变异菌株的出现[27]。所以，需要进一步关注OS-MRSA菌株在食品中的污染情况，及其是否通过食物链进行传播。

在本研究中，MRSA菌株对肠毒素基因的携带率较低，只携带seb、seg、sei、sem、sen、seo、sep和seq肠毒素基因，且只分布在生肉和熟肉制品的样本中，这与之前报道的MRSA菌株较少携带肠毒素基因的研结果一致[10,28]。本研究ST5型菌株携带完整的egc（seg、sei、sem、sen和seo）基因簇基因，且具有较高的耐药性，是否存在毒素基因随着耐药基因转移而转移，需要引起关注。关于毒素基因的转移研究还不够深入，还需要进一步研究。除此之外，所有的食源性MRSA菌株均携带溶血素基因，其中hla和hld基因携带率为100.0%（9/9），hlb也有较高的携带率（77.8%，7/9）。溶血素是金黄色葡萄球菌分泌的一种强致病性毒素因子，主要作用于宿主的细胞膜并对其造成损伤，也能破坏血小板，从而造成机体失血[29]。目前金黄色葡萄球菌溶血素已经被纳入评价疾病的流行及严重程度的标准[30]。值得注意的是，有报道称金黄色葡萄球菌感染患者在治疗过程中，随着在CIP等抗菌药物的压力及患者免疫系统降低的条件下，β-溶血素的表达增多，进而加重患者的病情[31-32]。虽然溶血素致病机制的研究还存在争议，但不能忽视其在抗生素压力下会进一步促进溶血素的表达，严重威胁着人体健康。对于其他毒素因子如杀白细胞素pvl基因在MRSA菌株中均有检出，已经有大量的研究表明pvl基因主要发现与CAMRSA菌株中，可以导致坏死性肺炎，降低患者的存活率[33-34]。由此说明，可能存在社区型MRSA对食品的污染，这要求相关从业人员注意规范操作及售卖环境的清洁，同时确保相关操作人员的定期健康体检。

本研究共检测出6 种分子型，主要为ST59-IVa-t437（33.3%，3/9）和ST88-III-t14340（22.2%，2/9），其次为ST398-IVa-t034、ST630-III-t4549、ST5-II-t002和ST4495-t10738（11.1%，1/9）。所有分离自生肉制品的MRSA克隆型均为ST59-IVa-t437。此外，根据现有报道ST59-IVa-t437属于CA-MRSA[35-36]，表明应加强对MRSA菌株相互传播的关注。在本研究熟肉制品中分离到2 株携带pvl基因的ST88-III-t14340型菌株，杨永刚[37]报道该菌株主要发现于医院，且具有较强的致病性。目前，关于该类菌株鲜有报道，但其造成的感染不容忽视。此外，在生肉制品中还分离到1 株ST398-IVa-t034型菌株，ST398 MRSA主要对家畜造成感染，而感染人类的ST398菌株和受污染的ST398食品通常对甲氧西林敏感[38-39]，这与本研究结果存在明显差异，对该类菌株的研究应进一步深入。在熟肉制品中还分离到1 株ST5-II-t002型菌株，该谱系菌株主要定植于医院和社区[40-41]，很少有污染食物的报道，但其超耐药和携带较多的毒素基因，一旦在医院和食物之间相互传播，将会给医院治疗和人体健康造成巨大威胁。另外，在凉拌菜中分离到的1 株ST630 MRSA菌株，该谱系菌株在中国已被广泛报道[42-43]。相比之下，其他国家对ST630 MRSA菌株的报道较少，这可能是由于不同区域饮食结构不同造成。综上结果表明，上海市食源性MRSA不仅谱系丰富，而且较多谱系与动物源、社区和医院MRSA相关。因此，不能忽视MRSA菌株通过养殖环节、食品制作者或者食品加工环节传播给食物的可能，需要防范MRSA菌株的传播。

本研究结果说明，上海市食源性MRSA污染率较低，其主要污染食源性动物制品及手工食品。此外，分离到的MRSA菌株具有耐药性强，谱系丰富，很多与动物源、医院和社区流行谱系相同，且所有的菌株均携带pvl基因，综上数据表明动物养殖环境以及在食品加工过程中都有可能造成MRSA污染到食品中。因此，不仅要严格控制抗生素的使用，还应规范食品加工操作、提升食品加工技术以及改善售卖环境，这些都是预防MRSA污染与传播的关键环节。