桦褐孔菌多糖对高脂饮食诱导的高脂血症大鼠血脂和肝脏的保护作用及机制

崔敬爱，王思霁，刘 畅，于 婷，陈晓平

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

近年来，随着人们生活水平不断提高，高脂肪和高蛋白摄入量的增加以及运动量的减少，导致血液中大量脂肪聚积，高脂血症的发病率急剧增长[1]。据统计，由高脂血症而引起的如冠心病、动脉粥样硬化等并发症的人群同时在逐年递增，并呈现低龄化趋势[2-3]。临床使用较多的控制血脂水平的药物为他汀类和贝特类，其优点为使用初期疗效显著，但长期服用会产生副作用，严重危害患者健康[4]。因此，饮食干预的方法引起了我国居民的注意，健康、安全、可用于降低血脂水平的天然产物受到了广泛的关注[5-6]。

桦褐孔菌（Inonotus obliquus (Fr.) Pilat），又称白桦茸、西伯利亚灵芝等[7]。桦褐孔菌主要生长在俄罗斯、日本、黑龙江、吉林长白山等寒冷地区，因此桦褐孔菌能够耐受零下40～50 ℃的低温[8]。桦褐孔菌具有降糖降脂、抗癌、抗氧化、提高免疫力等作用，能有效预防和治疗肿瘤、肝脏疾病、胃肠道及食道疾病等[9-10]。众多研究发现，桦褐孔菌药用主要活性成分是多糖，它可以有效消除活性氧自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基等[11]。桦褐孔菌多糖的降血脂作用报道较少，其研究的作用效果仅限于对血清总胆固醇的影响。本实验旨在通过高脂饮食诱导雄性SD大鼠引发高脂血症，探讨桦褐孔菌多糖对高脂血症大鼠血脂水平和肝损伤机制的影响。本研究对于桦褐孔菌及桦褐孔菌多糖类保健食品的开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

40 只体质量180～220 g的SPF级雄性SD大鼠，由吉林农业大学动物科学学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（吉）2018-0007。

高脂饲料配方：普通饲料73.8%（质量分数，下同）、胆固醇10%、猪油10%、胆酸盐0.2%、蛋黄粉1%、蔗糖5%[12]。

饲养条件：室温20～25 ℃、相对湿度40%～60%的清洁级动物饲养室，笼具及垫料定期清洗更换。

桦褐孔菌为市售；无水乙醇、氯仿、正丁醇河南西伯化工产品有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）试剂盒、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）试剂盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（asparate aminotransferase，AST）试剂盒、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）试剂盒、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（human hydroxymethylglutaryl CoA reductase，HMGCR）试剂盒 上海颖心实验室设备有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

H01-B电子天平 北京和田兴业仪器有限公司；HB-6磁力搅拌恒温水浴锅 金坛市良友仪器设备有限公司；RE-52CS旋转蒸发器 巩义市予泰仪器设备有限公司；FD-2A-30真空冷冻干燥机 江苏天翔仪器有限公司；LG16高速离心机 北京雷勃尔设备有限公司；UV762型紫外-可见分光光度计 上海精科仪器厂；SPX-600立式压力蒸汽灭菌器 济南捷岛分析仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌多糖的提取

桦褐孔菌在进行粉碎、除杂、干燥后，过40 目筛。

量取1 kg桦褐孔菌菌粉，加4 倍蒸馏水，100 ℃水浴30 min，过滤，滤渣按料液比1∶2加蒸馏水，100 ℃水浴30 min，过滤，混合2 次滤液，70～80 ℃浓缩至800 mL，10 000 r/min、25 ℃离心15 min，收集上清液，70～80 ℃浓缩至200 mL，加无水乙醇，让乙醇在体系中的体积分数达到80%，静置24 h，离心取沉淀。按氯仿：正丁醇体积比5∶1配制Sevag试剂，数次对沉淀脱蛋白，12 h流水透析，12 h蒸馏水静置，浓缩，冷冻干燥即得桦褐孔菌多糖[13]。经多次实验，得出桦褐孔菌多糖的平均提取率为5.89%，多糖的质量分数为83%。

1.3.2 实验动物分组设计

40 只雄性SD大鼠普通饲料适应喂养1 周，将其随机分为5 组，即正常对照组（Control）、高脂模型组（Model）以及桦褐孔菌多糖低剂量组（IOP-L）、中剂量组（IOP-M）、高剂量组（IOP-H），每组8 只[14]。正常对照组饲喂普通饲料，其余各组大鼠进行高脂饮食，实验期间自由采食、采水。

8 周后，禁食不禁水12 h，除正常对照组外，各组随机抽取2 只大鼠，测定血清TC、TG水平，判定高脂血症大鼠模型是否构造成功。确定造模成功后，上午灌胃1 次/d，连续干预5 周。分组灌胃剂量见表1。

表1 实验动物分组设计Table 1 Experimental design and animal grouping

1.3.3 检测指标

灌胃5 周后称量各组大鼠的体质量，禁食不禁水12 h，腹主动脉取血，颈椎脱臼致死，解剖，分离心、肝、脾、肾等脏器，用生理盐水冲洗干净，吸干多余水分。肝脏放入冷冻管中，保存备用。

1.3.3.1 SD大鼠体质量的测定

实验期间每天观察大鼠的进食、排泄状况，每周称量一次体质量并记录。

1.3.3.2 SD大鼠血清指标的测定

将采集的血液样本常温放置2 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离血清，根据试剂盒说明书逐一测定TC、TG、HDL、LDL的浓度并记录。

1.3.3.3 SD大鼠肝组织匀浆及肝脏指标的测定

量取肝脏0.1 g，加入0.9 mL冰冷的生理盐水，于冰水浴中充分研磨，制成1 g/10 mL的匀浆，3 000 r/min、4 ℃离心15 min取上清液。按照试剂盒说明书测定SOD、MDA、GSH-Px、AST、ALT、FAS、HMGCR的活力并记录。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2019软件对数据进行处理，SPSS 20软件进行统计分析，所有数据均以平均值±标准差表示，组间t检验分析差异显著性，P＜0.05表示组间差异显著，P＜0.01表示组间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌多糖对大鼠体质量的影响

图1 桦褐孔菌多糖对大鼠体质量的影响Fig. 1 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on body mass of rats

如图1所示，建模期间，桦褐孔菌多糖各剂量组较对照组大鼠体质量增长速率较快，说明食用高脂饲料能显著增加体质量。灌胃两周后，IOP-H组开始与模型组呈显著性差异（P＜0.05）；5 周后，各剂量组与模型组呈极显著差异（P＜0.01）。可以看出，桦褐孔菌多糖能有效减轻高脂饮食诱导的大鼠体质量的快速增长。

2.2 桦褐孔菌多糖对大鼠血清脂质水平的影响

2.2.1 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中TC浓度的影响

图2 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中TC浓度的影响Fig. 2 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum TC content in rats

如图2所示，模型组大鼠血清TC浓度极显著高于对照组（P＜0.01），表明高脂饮食显著提高大鼠血清TC的水平。与模型组相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H组大鼠血清TC浓度分别显著下降4.9%、5.8%、31%，说明桦褐孔菌多糖能够抑制大鼠血清中TC浓度的上升，并且高剂量效果尤为显著。

2.2.2 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中TG浓度的影响

图3 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中TG浓度的影响Fig. 3 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum TG content in rats

如图3所示，模型组大鼠血清TG浓度极显著高于对照组（P＜0.01）。与模型组相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H组大鼠血清中TG浓度分别极显著下降30%、42%、41.5%（P＜0.01）。说明一定剂量的桦褐孔菌多糖能够较好地调节血清TG水平。

2.2.3 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中HDL浓度的影响

如图4所示，模型组大鼠血清HDL浓度极显著低于对照组（P＜0.01）。与模型组相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H组大鼠血清中HDL浓度分别极显著上升16.9%、17.8%、13.2%（P＜0.01）。说明桦褐孔菌多糖可以显著提高血清HDL水平，且不受剂量影响。

图4 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中HDL浓度的影响Fig. 4 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum HDL content in rats

2.2.4 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中LDL浓度的影响

图5 桦褐孔菌多糖对大鼠血清中LDL浓度的影响Fig. 5 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum LDL content in rats

如图5所示，模型组大鼠血清LDL浓度极显著高于对照组（P＜0.01）。与模型组相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H组大鼠血清中LDL分别显著降低4.2%、9.6%、33%。说明桦褐孔菌多糖能够有效降低血清中LDL的水平，高剂量作用效果更加显著。

2.3 桦褐孔菌多糖对大鼠抗氧化指标的影响

2.3.1 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏中SOD和GSH-Px活力的影响

图6 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏中SOD和GSH-Px活力的影响Fig. 6 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on the activity of SOD and GSH-Px in rat liver

SOD是体内清除自由基的重要活性物质，GSH-Px也具有清除自由基和衍生物的作用，而且可以间接反映出肝组织的还原能力[15]。图6显示了灌胃5 周后各组大鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px的变化。模型组大鼠肝脏中SOD和GSH-Px的活力较对照组极显著下降（P＜0.01），这说明高脂饮食引起机体清除自由基的能力被有效削弱。IOP-H组SOD和GSH-Px活力较模型组分别极显著提升了14.7%和38.1%（P＜0.01），表明一定剂量的桦褐孔菌多糖能够提高机体SOD和GSH-Px的活力，使大鼠肝组织消除氧自由基和抗氧化能力增强。

2.3.2 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏中MDA含量的影响

图7 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏中MDA含量的影响Fig. 7 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on MDA content in rat liver

生物体发生脂质过氧化的最终产物有很多，其中水平最高的为MDA，它会加剧生物膜的损伤[16]。图7显示了灌胃5 周后各组大鼠肝组织中MDA含量的变化。模型组大鼠肝脏中MDA含量较对照组上升了58.6%（P＜0.01），说明高脂饮食削弱生物体抗氧化能力。与模型组相比IOP-L、IOP-M和IOP-H组大鼠MDA含量分别极显著下降8.4%、11.5%、21.7%（P＜0.01）。表明桦褐孔菌多糖能有效抑制机体的过氧化作用、抑制MDA的产生从而减少脂质过氧化损伤。

2.4 桦褐孔菌多糖对大鼠肝损伤指标的影响

图8 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏中ALT和AST活力的影响Fig. 8 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on ALT and AST levels in rat liver

由图8可知，模型组大鼠肝脏中ALT和AST的活力明显高于对照组（P＜0.01），说明长期食用高脂饲料会损害大鼠肝脏细胞。桦褐孔菌多糖各剂量组大鼠的ALT和AST活力均低于模型组（P＜0.01），说明桦褐孔菌多糖可以降低由高脂饮食造成的肝细胞损伤。

2.5 桦褐孔菌多糖对高脂血症大鼠代谢指标的影响

2.5.1 桦褐孔菌多糖对大鼠FAS活力的影响

图9 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏FAS活力的影响Fig. 9 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on the activity of FAS in rat liver

如图9所示，模型组大鼠的FAS活力较对照组升高了24.5%（P＜0.01）。与模型组相比，IOP-H和IOP-M组FAS活力分别下降21%和19.4%，说明桦褐孔菌多糖在一定剂量下能够抑制脂肪酸合成酶的活性。

2.5.2 桦褐孔菌多糖对大鼠HMGCR活力的影响

图10 桦褐孔菌多糖对大鼠肝脏HMGCR活力的影响Fig. 10 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on HMGCR activity in rat liver

HMGCR是体内催化胆固醇合成的关键酶[17]。如图10所示，模型组大鼠的HMGCR 活力较对照组升高了12.5%（P＜0.01），说明高脂饮食会促进大鼠体内HMGCR活力升高，胆固醇合成速率加快。与模型组相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H组HMGCR活力分别降低9%、18.6%、23%。结果表明桦褐孔菌多糖通过抑制HMGCR的活性来减缓胆固醇合成的速率，进一步起到降低血脂的作用。

3 讨 论

高脂血症是一种由脂质代谢紊乱引起的常见疾病，它是冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化等疾病的导火索，将会对人体造成系统性、严重时不可逆转的伤害[18]。据调查，世界上每年由于心脑血管疾病而死亡的人数高达1 200万[19-20]。生物体都是通过血液将脂类物质运转于各个器官和组织之间，血液中脂类物质的浓度可以直接并充分地反映机体的脂肪代谢情况[21]。高脂血症患者的能量摄入比普通人高，血液黏稠，主要临床表现为血液中TC、TG、LDL水平异常升高和HDL异常降低[22]。实验结果说明，桦褐孔菌多糖能有效控制高脂饮食引起的高脂血症大鼠的体质量，并能降低大鼠血清中TC、TG和LDL的浓度，增加HDL的浓度，具有调节血脂水平的作用，对于高脂血症的预防和治疗具有重要意义。

大量临床数据显示，高血脂的发生与氧化应激反应密切相关，氧自由基的增多和过氧化损伤会加剧高血脂的发生。当机体血脂水平升高时会继续引发血管内皮细胞释放自由基，动脉壁的抗氧化机能被二次损伤，生物体内自由基的浓度不断增加，生物膜的脂质过氧化反应发生，如此往复，生物细胞的结构和功能遭到严重破坏。植物多糖的抗氧化作用已被大量研究证实，因此，可以初步判断桦褐孔菌多糖的降血脂作用与抗氧化损伤有关。作为清除氧自由基的重要物质，SOD可以帮助机体建立抗氧化系统，在生物体的新陈代谢过程修复细胞膜的损伤[23]。GSH-Px可以催化还原反应，反向抑制生物体内过氧化物的产生速率，增强生物膜的功能特性[24]。MDA是过氧化反应的终产物，它具有剧毒，会改变血液中脂类物质的结构与特性[25]。通常以这3 个指标反映机体脂质过氧化损伤的程度。本实验给予高脂血症模型大鼠桦褐孔菌多糖5 周后，肝脏中SOD、GSH-Px的活性显著提高，MDA含量降低。结果证实，桦褐孔菌多糖可以通过提高抗氧化物酶的活性、降低脂质过氧化物的浓度，增加机体清除氧自由基的能力起到抗氧化应激、防止氧化损伤的效果，最终达到降血脂作用。

当机体脂质过氧化反应持续一段时间后，会对肝细胞线粒体造成一定程度上的损害，导致大量肝细胞损害甚至死亡，对机体产生不可逆的伤害[26]。ALT和AST是存在于肝脏细胞中主要的转氨酶，可以作为肝细胞损伤的主要敏感性指标，以ALT和AST的水平反映肝脏的健康状况[27-28]。结果表明，在桦褐孔菌多糖的调节作用下，大鼠肝脏中ALT和AST的活性明显下降，说明桦褐孔菌多糖可以极大程度减轻肝细胞受损的程度。

多糖类化合物调节脂质代谢的机理主要有减少生物体脂质的吸收、降低脂肪的摄入量、抑制脂肪酸合成代谢的关键酶的活性等几个方面。FAS是合成脂肪酸的重要控制酶，主要存在于肝细胞线粒体当中，HMGCR是催化胆固醇合成的重要酶，它的活性可以反映机体合成胆固醇和脂肪酸的能力[29]。实验结果证实，桦褐孔菌多糖能够较明显地抑制模型大鼠肝脏中FAS和HMGCR的活力，从而降低脂肪酸的合成与代谢，抑制胆固醇的合成，在机体代谢调节方面降低血脂水平。

药用真菌多糖是调节血脂的主要功能因子之一，大量动物实验表明，多糖及富含多糖类化合物的物质具有显著的降血脂效果。其作用机制包括促进胆固醇酯化进入肝脏，从而加速清除血液中的胆固醇，进一步降低血脂[30]。多糖类物质是桦褐孔菌中的发挥主要作用的功能成分，它与加强机体抗氧化活性、降低脂质过氧化损伤有密切相关。本研究表明了桦褐孔菌多糖与脂血症患者的血脂水平之间有一定的量效关系，桦褐孔菌多糖降血脂作用可能与抑制机体过氧化损伤、降低胆固醇的合成有关，但是具体作用机理还需进一步的研究。