兔急性骨骼肌损伤模型的建立及分期确定

吴安林，艾珏萍，谢秀惠，叶 平，杨 程，卢 园，陈海南，彭 亮

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙，410208）

骨骼肌损伤为日常生活中最常见的损伤之一，其常发生于体育锻炼及运动训练中。骨骼肌损伤后不仅会产生强烈的疼痛、肌肉僵硬及挛缩，导致运动功能障碍及丧失，严重影响正常的工作、学习和生活，还会对人们的健康及生活品质造成潜在的威胁。故充分研究骨骼肌损伤机制，观察骨骼肌组织形态的病理变化过程显得极其重要。在研究急性骨骼肌损伤过程中，动物实验造模方法是实验研究的首要环节，其直接影响到实验结果的科学性。相关文献显示，急性骨骼肌损伤造模方法主要有重复性肌肉拉伸、电刺激、下坡跑、钝性挫伤、锐性不横断切割及缺血再灌注等［1-6］，而重物打击致伤（属于钝性挫伤）的造模方法最为常见，故本实验改良了一种重物打击造模方法进行急性骨骼肌损伤造模并对其进行相关观察。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂与仪器 常规化学试剂（上海国药生物有限公司）、石蜡（Sigma）、中性树胶（Sigma）、苏木素（Wellbio）、PBS（7.2~7.6）（Wellbio）、伊红（Wellbio）、多聚甲醛（Sigma）、摇床、恒温箱、切片机、包埋机、显微镜。

1.1.2 实验动物 健康清洁级新西兰大白兔16只、3 个月月龄、雌雄各半，由湖南中医药研究院实验动物中心提供，分笼喂养、自由饮水、室温控制在 20 ℃~25 ℃。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 采用并改进文献［7-9］重力锤自由下落打击造模方法进行造模，建立骨骼肌急性损伤模型。16 只新西兰大白兔进行分笼适应性喂养7 d 后，随机编号为1~16。为达到最接近人体皮肤的效果，对新西兰兔进行剃毛处理，剃去兔右后肢浓厚的毛发。随后抽取其中4 只进行拟造模，将实验兔以腹面朝上捆绑于实验台，充分暴露其右后股四头肌及相邻部位肌肉，选取股四头肌肌腹中段为打击点，以其中点为圆心、直径为1 cm进行画圈标记，并于打击部位覆盖一层纱布以防局部皮肤受损；为保证重力锤下放速度及外力因素的一致性，由专人控制重力锤（质量850 g，打击头为平滑木制圆柱，直径1.5 cm）沿不锈钢导向管（长30 cm，中空，直径 1.8 cm）于高40 cm 处自由下落，同一部位连续进行6 次打击，动能为3.33 J，冲量为2.38 N/s，打击面积大约为1.77 cm2；为确保连续6 次不同打击均能打击在股四头肌的同一位置，由专人用双手拇食指固定兔股四头肌上下端以防造模时因实验兔挣扎而造成打击点移位；以肉眼可见打击部位皮肤出现明显肿胀及瘀血，未见皮肤受损及骨折、触碰时有躲避反射暂拟为造模成功。

1.2.2 实验取材及处理 于实验兔耳缘静脉注入适当空气将其进行处死后立即取材，对受伤局部骨骼肌组织进行取样（大小约为8 mm×8 mm），4%多聚甲醛固定1 周，石蜡包埋，切片机切片及常规HE 染色后在光镜下进行观察：以可见肌纤维肿胀、变性，肌溶解以及局灶性坏死、肌纤维间水肿、炎症细胞浸润等骨骼肌组织形态学改变为造模成功。数据结果显示拟造模成功后，对剩余的12 只实验兔如法进行造模，造模后每日喂食量、室温等其他条件均与造模前完全保持一致。造模后每天分别于上午 9：30、下午 16：30 两个时间点对实验兔进行日常观察，观察其进食、活动、精神状态、情绪及二便等情况；此外，分别于造模后第 1、3、5、7 天抽取 3 只实验兔进行处死并取材，经HE 染色等相关处理后在光镜下进行形态学观察。

2 结 果

2.1 日常行为学观察

造模后第1、2 天：实验兔精神状态较差，蜷缩于兔笼角落，活动减少，惧人，部分实验兔进食量较前稍减少，大小便情况较造模前无明显变化；造模后第3、4 天：实验兔精神状态较前明显好转，活动量较前增加，进食量及大小便情况较造模前无明显变化；造模后第5、6、7 天：实验兔精神状态恢复如常，活动量、进食及大小便等情况与造模前均无明显差异。

2.2 形态学观察

造模后不同时段形态学观察量表见表1，光镜下形态观察图见图1。

图1 造模后不同时段光镜下形态学观察图

表1 造模后不同时段形态学观察量表

造模后第1 天：可见肌间隙增宽，肌纤维肿胀，间质水肿，肌细胞间可见大量血液渗出，炎症细胞浸润，部分肌纤维断裂及细胞形态改变。造模后第3 天：大量炎症细胞浸润，肌细胞间可见大量红细胞，可见纤维素样物及空泡样改变。造模后第5 天：细胞间隙较前明显缩小，炎症细胞浸润较前减轻，间质中可见大量成纤维细胞及毛细血管增生，肉芽组织增生，可见多核巨细胞。造模后第7 天：细胞间隙未见明显水肿及出血，炎症细胞数量较前明显减少，大量肌纤维产生，瘢痕组织形成。

3 讨 论

在已有的众多造模实验中，重力锤质量、直径以及下落高度均不同，且差距较大，故在进行正式造模前，本研究特意设置了“预造模”的环节，在参考已有的造模相关数据的基础上，设置了多组不同的重力锤质量、直径以及下落高度，经过反复多次的造模及对实验结果的仔细分析后得出最佳数据组以确保造模方法的可行性及准确性，并根据冲量及动能的大小对重力锤重量、下落高度及打击次数进行了相应的改动以达到最佳的打击造模效果。相对原造模方法，本研究在进行造模时采用了隔离模式进行造模，可防实验兔在造模前受到惊吓导致肌肉紧张而影响造模效果；在对实验兔进行常规捆绑、精准定位及标记之外，还采用了专人双手对实验兔股四头肌上下端进行双重固定的方法，以确保多次打击的作用点在同一位置，从而保证每次打击的有效性及造模的精确性。打击头为平滑木制圆柱，可避免因打击点不光滑而导致肌肉不均匀的创伤及出血；其直径为1.5 cm，可避免因直径太大而导致造模时打击到股骨造成骨折，甚至打击到股动脉而造成动脉破裂导致大出血。

通过光镜下观察，造模后第1 天可见肌纤维明显肿胀及部分断裂，出血及炎症反应发生，为骨骼肌急性损伤之后典型的正常生理反应表现，说明骨骼肌急性损伤造模成功；结合行为学观察，其精神状态及活动量均明显下降，符合实验兔骨骼肌急性损伤后表现特点。第3 天炎症反应进一步升级，可见大量炎症细胞浸润，纤维素样物的产生及空泡样改变说明肌细胞存在变性、坏死与崩解，此阶段符合急性炎症期的形态学改变，行为学观察显示实验兔精神状态等均较第1 天有所好转。造模后第5 天细胞间隙减小，炎症细胞开始减少，说明细胞水肿及炎症反应开始减轻；成纤维细胞开始出现，其可与新生毛细血管共同形成肉芽组织，说明开始进入组织机化期，此时行为学观察显示实验兔已恢复如常，与造模前基本相同。造模后第7 天肌纤维及瘢痕组织的形成典型的组织机化期表现，说明正式进入组织机化期。

本研究通过对骨骼肌急性损伤后实验兔日常行为学及形态学观察证明了急性骨骼肌损伤分期模型方法的可行性及可复制性。但本研究仅对实验兔骨骼肌损伤急性期进行了短期的观察，后续进一步长期的观察可更加完整地体现整个骨骼肌损伤的修复过程。此外，本研究仅局限于对骨骼肌损伤后自然修复过程的观察，若同时与采用不同手段进行干预相对比，研究将具有更加重要的意义。