充血对SOS 法分离猪胰岛效果的影响

董允豪 金 月 崔成都 朴明淑*

（1、延边大学 吉林省转基因动物与胚胎工程重点实验室，吉林 延吉133002 2、吉林省龙井市林业局草原管理站，吉林 龙井133400）

SOS 法是2010 年 Atwater等[1]学者开发的一种动物胰岛分离方法，认为该方法与传统的胶原酶法相比，有以下优点具有常温或低温下进行、可保证胰岛的完整性、价格低廉等优点。2009 年Hilling 等[2]学者在进行人类和猪胰腺胰岛分离过程中，发现收集到的胰腺中，近46%的胰腺呈充血状态，且这些处于充血状态的胰腺在酶消化法分离的产量明显下降，尤其在猪的胰腺分离过程中。因此，充血对动物胰腺胰岛分离具有一定的影响。那么，充血在SOS 法分离胰腺胰岛有何影响，未见报道。因此，本试验以屠宰猪胰腺为试验材料，采用SOS 法对充血和未充血状态的胰腺进行胰岛的分离提纯试验，为开发新的胰岛分离提纯方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料本试验取充血和非充血屠宰猪胰腺各5 例，均由延吉猪屠宰场提供。

1.1.2 主要试剂PBS 缓冲液、RPMI-1640 培养液、无水葡萄糖、Hanks、Histopaque-1077 胎牛血清、青链霉素、吖啶橙AO、溴化乙啶EB、DTZ、台盼蓝等。

1.1.3 主要仪器病理组织包埋机、石蜡切片机、摊片机、烘片机、超净工作台、电子天平、离心机、光学显微镜数码图像采集系统(BH-2) 、CO2 恒温培养箱、体式显微镜、酶标仪、实体显微镜等。

1.2 方法

图1 屠宰猪胰腺HE×200 A：未充血胰腺；B：充血胰腺

1.2.1 胰腺的获取、运输及取材屠宰场放血致死后，剖腹迅速摘取胰腺放入含有双抗的PBS 的保温壶中，立即运回实验室进行胰岛分离（热缺血时间控制在10 min 以内，冷缺血时间控制在30 min 以内。取部分胰腺组织放入10%福尔马林固定用于石蜡切片制作。

1.2.2 猪胰腺的HE 染色取材固定，制作石蜡组织切片，HE染色，显微镜下观察并照相。

1.2.3 基于SOS 法的猪胰岛分离纯化采用Enck K（2017）所介绍试验方法，分别对充血和未充血胰腺，进行猪胰岛的分离纯化、并计算出胰岛产量、纯度、存活率及、的鉴定、计数及胰岛素刺激指数(SI）。

1.2.4 统计分析本试验数据均用SPSS17.0 统计软件分析，采用mean±SD 表示，P<0.05 具有差异显著性，P<0.01 具有差异极显著性。

2 结果

2.1 充血和非充血屠宰猪胰腺的组织学特征

图2 屠宰猪胰岛纯化前、后DTZ 染色（×100）

光镜下，未充血屠宰猪胰腺分为内分泌腺和外分泌腺，外分泌腺占胰腺的绝大部分。胰岛发育较完全，胰岛轮廓清晰，呈圆形或椭圆形，而充血屠宰猪胰腺外分泌腺和内分泌腺分界不清，组织间隙扩大，组织的嗜酸性增强，且大部分细胞出现核浓缩现象（如图1）。

2.2 基于SOS 法的屠宰猪胰岛的形态特点

基于SOS 法分离的屠宰猪胰岛被DTZ 染成猩红色，多呈圆形或椭圆形，对胰岛纯化前后进行染色对比，纯化前含有较多的胰岛碎片和外分泌细胞碎片，纯化后细胞碎片明显减少，胰岛纯度提高。细胞压片后胰岛外ECM 保留完好（如图2）。

2.3 采用SOS 法分离提纯充血和非充血屠宰猪胰腺胰岛效果比较

在高糖浓度为500 mmol/L 下，采用SOS 法分别分离提纯充血和未充血胰腺胰岛。未充血胰腺平均产量为5840±625 个/g，纯度为93.8±0.9%，刺激指数为1.93±0.18，存活率为95%（如表1）。

表1 SOS 法和胶原酶法分离提出胰岛

3 讨论

基于SOS 法的胰岛分离方法是分离胰岛的一种新方法，与胶原酶灌注分离胰岛相比，SOS 法具有在常温或低温下进行减缓细胞的凋亡速率、能保证胰岛的完整性、分离过程中不产生对胰岛有害的物质、价格低廉等优点[1]。本试验在未充血屠宰猪胰腺的SOS 法分离中获得平均产量为5840±625 个/g、纯度为93.8±0.9%、刺激指数为1.93±0.18、存活率为95%的较好的效果，且分离出的胰岛形态均呈圆形或椭圆形，胰岛表面光滑，符合胰岛移植的形态学要求，但在充血胰岛中未能分离出胰岛，说明充血胰岛不适用于SOS 法。因此，在今后的试验中应注意分离提纯前对试验材料的筛选。

关于充血胰岛，Hilling 等[2]学者在胶原酶法分离提纯胰岛的试验研究中发现，充血的人类和猪胰腺中内分泌含量较高，且分离提纯的胰岛产量相比未充血胰岛低，因此推测处死动物的某环节（如猪屠宰过程中的电击等）导致动物的血压升高，使胰腺充血所致。本试验结果表明，未充血屠宰猪胰腺内、外分泌腺部界限清晰，外分泌腺占胰腺的绝大部分，胰岛轮廓清晰，呈圆形或椭圆形，而充血屠宰猪胰腺外分泌腺和内分泌腺分界不清，组织间隙扩大，组织的嗜酸性增强，且大部分细胞出现核浓缩现象。充血胰腺的这种组织学变化特点，表明胰腺由于充血导致水肿，使组织间隙扩大，同时充血导致一些物质的分泌导致胰腺构成细胞的损伤。