鼠麴草对大鼠痛风性关节炎的治疗作用及其机制*

黄蕾，杨全伟，夏俊锋，刘新国

(1.武汉市第一医院药学部，武汉 430022；2.湖北省仙桃市公共检验检测中心，仙桃 433000)

痛风性关节炎(gouty arthritis，GA)是由于血液中尿酸增高及尿酸盐结晶(sodium urate crystal，MSU)析出，沉积在关节组织引起关节滑膜及周围组织炎症反应和病理性损伤。该病致残率和致畸率较高，给患者生活和健康带来不便[1-2]。固有免疫在GA发展中起重要作用，多种免疫细胞及炎症因子通过识别尿酸钠，激活细胞内信号传递，进而调控凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)成熟，其中NALP3炎性体(NACHT-LRR-PYD-containing proteins-3，NALP3)是该过程中重要的信号活化产物[3]。NALP3由3部分组成：NLR家族蛋白、ASC起连接作用、caspase-1。3个组成部分均在MSU诱导的炎症反应中发挥重要作用[4-5]。

鼠麴草具有祛风除湿功效，是治疗咳嗽、哮喘和痛风的传统中草药[6]。笔者在本研究通过制备GA大鼠模型，并给予不同剂量鼠麴草进行干预，观察鼠麴草对GA的治疗效果以及与NALP3炎性体信号通路的关系[7]。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性Wistar大鼠60只，体质量180～220 g，6～8周龄，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2019-0009，饲养条件：12 h明暗交替，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，适应性喂养7 d后开始实验。

1.2药品与试剂 鼠麴草药材饮片购自安徽省亳州市仁惠堂中药材销售有限公司，样品经湖北省药品监督检验研究院李丹平主任药师鉴定为菊科植物鼠麴草(GnaphaliumaffineD.Don)的全草；秋水仙碱片(广州彼迪药业有限公司，批号：180921)；尿酸钠(上海源叶生物科技有限公司，批号：180813)，尿酸(uric acid，UA)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(均购自南京建成生物科技有限公司，批号分别为20190605，20190703，20190313，20190625)，兔抗大鼠NALP3单克隆抗体、兔抗大鼠ASC单克隆抗体、兔抗大鼠caspase-1单克隆抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(上海碧云天生物科技有限公司，批号分别为AF2155、AF1681、AF0246、AF0003)。

1.3仪器与设备 CLF-40型密封型手提式粉碎机(广州大祥电子器械厂)，ZNHW-II电热套(山东甄诚实验设备有限公司)，RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)，TG16G型低温高速离心机(常州市亿能实验仪器厂)，电子天平(德国赛多利斯公司，BP190S型，感量：0.1 g；BSA124S型，感量：0.1 mg)，BW-PVM802型足趾容积测量仪(上海软隆科技发展有限公司)，ELX800型酶标仪(青岛聚创环保设备有限公司)，ChemiDocXRS型化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)，AR-21型组织染色机(湖北安立信医疗实业有限公司)，CX31型生物显微镜(奥林巴斯有限公司)。

1.4鼠麴草醇提物的制备 将鼠麴草干燥后打成粗粉，取粗粉1 kg，加95%乙醇8 L，浸泡过夜后连续加热回流提取2次，药材残渣继续以同体积80%乙醇提取1次，将3次提取液合并，旋转蒸发仪浓缩，得黏稠浸膏，真空干燥得总醇提干浸膏156 g，临用前用纯化水稀释成所需要浓度[8]。

1.5模型的制备 精密称取适量尿酸钠，以0.9%氯化钠溶液和聚山梨酯-80溶解，配制成20 mg·mL-1尿酸钠溶液。将大鼠仰卧固定于解剖板，右后肢小腿踝关节75%乙醇消毒，6号注射针以踝关节外侧为穿刺点，针口斜面朝上且与胫骨成45°刺入踝关节腔，注入尿酸钠液，每个关节0.2 mL，建立大鼠GA模型，正常对照组于相同部位注射等体积0.9%氯化钠溶液[9-10]。

1.6分组及给药 将大鼠随机分为6组：正常对照组，模型对照组，鼠麴草小剂量组、中剂量组、大剂量组，秋水仙碱组，每组10只。造模同时正常对照组和模型对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，鼠麴草小剂量组、中剂量组、大剂量组分别给予醇提物药液0.4，0.8，1.6 g·kg-1灌胃，秋水仙碱组给予秋水仙碱0.97 mg·kg-1灌胃。均每次2 mL，连续8 d。

1.7大鼠足跖肿胀率评价 于造模后1，8，12，24，48 h，用足趾容积测量仪测定各大鼠右后足跖容积，计算足跖肿胀率。足跖肿胀率(%)=(造模后足容积-造模前足容积)/造模前足容积×100%[11]。

1.8血清相关指标检测 实验第8天，给药30 min后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于解剖板，取腹主静脉血，分离血清，收集关节液，置于-80 ℃超低温冰箱保存备检。按照相关试剂盒操作步骤，检测血清UA、XOD、IL-1β、TNF-α。

1.9滑膜组织NALP3、caspase-1、ASC蛋白表达检测 采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)。取大鼠左后足膝关节滑膜组织，液氮速冻，加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液及蛋白酶抑制剂充分匀浆，4 ℃ 12 000 r·min-1(r=24 cm)离心15 min取上清液。取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃下与NALP3(1：200)、ASC(1：200)、caspase-1，(1：5000)或β-actin(1：5000)抗体共同孵育过夜，再与相应二抗室温下共同孵育1 h，滴加化学发光试剂(electrochemilu-minescence，ECL)后成像系统检测分析信号。以目的蛋白和内参蛋白的灰度值A比值代表目的蛋白相对表达量。

1.10组织病理学检测 取血后处死大鼠，快速分离踝关节周围软组织，10%甲醛溶液固定，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察大鼠踝关节组织病理学情况并摄像。

2 实验结果

2.1大鼠足跖肿胀率 与正常对照组比较，模型对照组各时间点足跖肿胀率显著升高(P<0.01)，表明造模成功。与模型对照组比较，鼠麴草小剂量组、中剂量组、大剂量组12～48 h肿胀率显著降低(P<0.05或P<0.01)，并呈量效关系，秋水仙碱组8～48 h足跖肿胀率显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

2.2UA、XOD、IL-1β、TNF-α水平 与正常对照组比较，模型对照组UA、XOD、IL-1β及TNF-α含量均明显增高(P<0.01)。与模型对照组比较，鼠麴草各剂量组与秋水仙碱组UA、XOD、IL-1β、TNF-α含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

2.3滑膜组织NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表达 与正常对照组比较，模型对照组滑膜组织NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均显著升高(P<0.01)；与模型对照组比较，鼠麴草各剂量组与秋水仙碱组滑膜组织NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结果见图1和表3。

2.4大鼠踝关节滑膜病理特征 正常对照组大鼠踝关节滑膜组织结构清晰，滑膜细胞排列整齐，无炎症细胞浸润，无滑膜细胞增生和毛细血管充血、水肿；模型对照组滑膜炎症明显，出现滑膜组织明显水肿，滑膜细胞排列紊乱伴细胞增生，并出现毛细血管增生，伴有大量炎症细胞浸润等炎症表现；与模型对照组比较，鼠麴草小剂量组、中剂量组、大剂量组及秋水仙碱组滑膜炎症反应均有不同程度减轻，中剂量组、大剂量组与秋水仙碱组病变减轻程度相当，炎症细胞少量、分散浸润。结果见图2。

表1 6组大鼠足跖肿胀率

表2 6组大鼠血清UA、XOD、IL-1β、TNF-α水平

A.正常对照组；B.模型对照组；C.鼠麴草小剂量组；D.鼠麴草中剂量组；E.鼠麴草大剂量组；F.秋水仙碱组。

Fig.1TheproteinexpressionofNALP3，Caspase-1andASCinsynovialtissueofrats

3 讨论

GA是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排出障碍导致的血UA升高，MSU沉积于组织或器官，引起组织损伤的一组临床综合征[12-13]。MSU沉积于细胞外，即能被细胞膜上Toll样受体识别，促使前体1L-1β合成，IL-1β被认为是最经典的炎症调节剂，是炎症调节的始动因素，可以启动和调节众多与炎症反应有关因子的IL-1、IL-6、TNF-α等表达[14-15]。XOD是体内催化黄嘌呤、次黄嘌呤氧化生成尿酸的酶，而血UA升高是痛风的重要生化基础，二者均是痛风发生发展的体内重要标志物[16]。研究表明，敲除NLRP3/ASC/caspase-1的小鼠用MSU晶体刺激后，IL-1β的成熟和释放受到明显抑制，敲除小鼠NLRP3时，IL-1β的产生同样受到抑制，注射MSU晶体后，中性粒细胞聚集消弱，证实NLRP3炎性体在痛风急性发作中发挥了重要作用[17-18]。

表3 6组大鼠滑膜组织NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表达

A正常对照组；B.模型对照组；C.鼠麴草小剂量组；D.鼠麴草中剂量组；E.鼠麴草大剂量组；F.秋水仙碱组。

本实验结果显示，MSU显著升高XOD活力，血UA也随之显著升高，给予小剂量、中剂量、大剂量鼠麴草干预后，二者水平均显著降低。MSU可显著增加IL-1β及TNF-α水平，而鼠麴草提取物能显著降低这些炎症因子的水平。模型对照组ASC、caspase-1和NALP3蛋白表达量显著上升，IL-1β释放减少，可能是MSU激活NALP3信号通路，上调IL-1β表达，促进了GA炎症反应发生和进展，鼠麴草各剂量组与秋水仙碱组NALP3/ASC/caspase-1蛋白表达显著下降，NALP3炎症体的组装被抑制，IL-1β的释放减少。综上所述，鼠麴草对大鼠GA有显著治疗作用，其作用机制可能与抑制NALP3炎性体激活、抑制XOD活性、减少UA生成、抑制炎性反应有关，本研究为进一步探索鼠麴草治疗GA的作用机制提供研究基础。

本研究存在一定局限性，炎症通路除了NALP3炎性体信号通路外，还有MAPK、TLRs等信号通路，本实验只选取了部分通路研究，对其他炎症通路并未涉及。另外发现鼠麴草治疗GA的药效较秋水仙碱稍弱，这可能与本实验干预时间较短有关，需要更长时间考察其药效。其次鼠麴草含有多种有效成分如黄酮类、三萜类、植物甾醇和咖啡酸衍生物等，笔者后续研究将选筛选出有效单体来进行实验，以进一步明确鼠麴草治疗GA的药理成分，解决其成分复杂作用不明确的问题。