鉴别紫芝菌株的PCR 引物筛选及其序列比对验证

钟礼义，陈体强，刘新锐，应正河，杨 驰

（1.福建武平县食用菌技术推广服务站，福建 武平 364300；2.福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州350014；3.福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】灵芝的商品化栽培（规范化种植）起源于20 世纪90 年代，福建省曾大力推广以赤芝6 号等为代表的优良栽培菌株[1-2]，成为国内最大的灵芝生产与出口基地。但2000 年以来，福建灵芝种植业受国家林业政策等影响，栽培用材短缺难以维持商品化种植的需求（人工培育灵芝专用林的成材期长达10—12 年），栽培量一落千丈。同时，长期以来人工栽培和加工利用的灵芝种类（品种）单一，难以满足多样化的市场需要，产业发展缺乏新的增长点。而野生紫芝种质资源的开发利用及其人工驯化栽培技术的推广应用，可再次促进福建省灵芝产业的发展，能成为山区扶贫致富的好项目。福建省灵芝科真菌资源中灵芝属的紫芝类（Sect.Phaeonema）有9 种[3]，其代表性种类是被称为中国灵芝的紫芝（G.sinense）、其近缘种的硬孔灵芝（G.duropora）[4]，这2 种紫芝常见于闽西北山区。【前人研究进展】紫芝是灵芝科灵芝属（Ganoderma）的重要类群紫芝组（Sect.Phaeonema），其特征是菌肉呈均匀褐色、深褐色至栗褐色；以Ganoderma sinense为中心的紫芝大种群是属于高温多雨气候型，分布在长江以南的8 个省区[5]。相较于栽培较广泛的赤芝（G.1ucidum）与松杉灵芝（G.tsugae），紫芝种质资源的开发利用相对滞后，市场上的灵芝或者灵芝类产品很少以紫芝为主要原料[6]。紫芝作为中药材灵芝来源菌物，自2000 年起被《中国药典》收录，但其栽培种质资源与遗传育种方面的研究报道较少，亟待加强。目前，我国人工栽培的紫芝菌种主要还是野外分离和驯化的菌株[7]，如闽紫96 和紫芝S2[8-9]。这2 个栽培菌株在栽培性状（朵型、大小）或子实体发育形态上有着很大的不同，其中闽紫96 菌盖小型，菌柄侧生、偏生为主，栽培单产仅有12.70 kg· m-3（干 品/菌 材），而 紫 芝S2 菌盖 大 型，菌柄中生、近中生，栽培单产平均可达25.05 kg·m-3（干品/菌材）。国内外学者根据（微观和宏观）形态特征上的不同，早在2005 年就描述了紫芝（G.sinense）的表型可塑性[10]，且基于系统发育分析，已有研究者提出将硬孔灵芝（G.duropora）与紫芝（G.sinense）归类为一个新的复合种——紫芝（Ganoderma duroporum comb.nov.）[11]。最近，来自中国境内不同产地的具有高度表型可塑性的20 份紫芝标本，从多基因序列比对结果也被证实为同一种[12]。【本研究切入点】经多年多点区域试验和Finlay 稳定性分析，紫芝S2 受栽培环境因素影响较小（稳定性好，适应性强），于2012 年获得新品种认定（品种认定号：闽认菌2012002），定名为武芝2 号[13]。紫芝S2 适于林下种植与大棚栽培，已在福建省闽西北推广应用多年，年产量可达300 t；近年来，紫芝S2 已经被引种至广东、广西、江西和浙江等省份，辽宁、黑龙江也有星零种植。为了避免与其他来源（遗传背景不同）栽培菌的株系混杂，本研究采用RAPD-PCR、ISSR-PCR 技术构建紫芝S2（Zizhi S2）的分子标记。【拟解决的关键问题】应用Primer-Blast 在线设计，将筛选得到的特异性PCR 引物短序列与紫芝S2 基因组全序列进行Blast 比对，反向验证其有效性，为紫芝菌株鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从不同单位得到的6 个紫芝栽培常用紫菌株（表1）。其中，1 号菌株紫芝S2 和2 号菌株紫芝X5均由福建省武平县食用菌技术推广服务站选育提供。紫芝S2 与紫芝X5、紫芝1、紫芝2、紫芝3、紫芝4等其他5 个菌株间均存在不同度的拮抗现象，菌丝表面形成带状拮抗线（图1）。

表1 供试紫芝菌株信息Table 1 Strains of cultivated Zizhi used in study

1.2 DNA 样品提取与检测

将供试菌株分别接种到贴有玻璃纸的PDA 平板中，封口倒置、于27 ℃培养，待菌丝长满平板收集菌丝，于预冷研钵中加入液氮研磨成细粉，采用改良CTAB法提取和纯化总DNA[14]。采用0.75%琼脂糖凝胶电泳（100 V 直流1 h，5～80 kb 脉冲16 h）检测DNA样品符合建库合格，Nanodrop 检测DNA 纯度（161.6 ng·μL-1），Qubit 快速荧光定量（154.0 ng·μL-1）。

1.3 RAPD、ISSR 扩增分析比较

采用Eppendorf Mastercyeter Personal PCR 扩增仪，PCR 试剂购自TaKaRa 有限公司（大连），候选RAPD、ISSR 扩增引物均从（上海）生工生物工程股份有限公司提供的引物产品中筛选，PCR 反应体系及扩增程序按照参考文献[14]。反应结束后，各取5 μL PCR 产物，加1 μL 溴酚蓝（6×）混匀，在1.0%琼脂糖凝胶（含Goldview TMDNA 染料0.5 μg·mL-1）上电泳，使用Marker 为DL2000，于4～5 V·cm-1电压下电泳约1.0 h，在JS-680 全自动数码凝胶成像系统上观察并拍照保存。

1.4 引物序列与基因组序列的比对

采用PacBio Sequel 三代测序平台完成紫芝S2 全基因组测序，组装得到72 条Scaffold（其中核基因组71 条，另文报道）；Blast 比对（BLAST, v2.2.26）检测每条Scaffold 上是否包含RAPD、ISSR 引物的短序列，并统计不同错配比对结果。

1.5 数据统计与处理方法

多态位点百分率计算公式为P =（k/n）×100%，k 为多态位点数，n 为检测位点总数；遗传相似距离计算采用Nei 氏公式S = 2Nxy/（Nx+ Ny），其中Nxy为菌株X 和Y 共有片段数，Nx、Ny分别为X 和Y 菌株扩增片段总数。采用NTSYSpc2.0 软件对菌株RAPD、ISSR 分子标记结果进行UPGMA 聚类分析，生成供试菌株的遗传聚类关系图。选取比对允许空位数为0 的Blast 结果（比对分数值Score 越大越好，e 值越小越好），采用Excel 2010 软件进行数据统计，分成比对允许错配为0 和1（即Gap=0；Mismatch=0, 1）两类结果。

2 结果与分析

2.1 鉴别菌株的分子标记短序列

筛选到2 个RAPD 引物：S1506（GGTGGCCA AG）和S1326（AGGCATCGTG），其扩增效果较好、重复性高，能稳定地扩增出特异性的条带；其中，在紫芝S2、X5 的图谱中分别呈现明显区别的1～3特异性条带，并且与4 个对照菌株的条带均能明显差异（图2）。同时，还筛选到3 个ISSR 引物：ISSR1（C ACCACACACACACACA）、ISSR2（AGAGACAGAG AGAGAGT）和ISSR13（TTCCCTTCCTTCCC），其扩增效果好、条带清晰且稳定，呈现多态性；共扩增出87 条带，其中表现出多态性的条带为59 条，多态位点百分率为67.82%。其中，紫芝S2、X5 彼此间呈现1～3 条特异性条带，也能与4 个对照菌株的条带明显区别开来（图3）。分析结果表明：采用S1506、S1326、ISSR1、ISSR2、ISSR13 共5 个短序列引物，扩增得到RAPD 和ISSR 图谱，均能够简单而有效地将紫芝S2 与其他紫芝菌株鉴别，可以考虑用于分子标记。

图1 紫芝菌株间的拮抗现象Fig.1 Antagonism between different Zizhi strains

图2 RAPD-PCR 扩增图谱Fig.2 RAPD-PCR amplifications

2.2 不同紫芝菌株间的遗传距离

通过聚类分析建立遗传相似距离矩阵，得到聚类图（图4）。结果表明，6 株菌株相互间的遗传相似距离在0.564～0.836；其中，1 号菌株（紫芝S2）与4 号菌株（紫芝2）之间的亲缘关系最近，而与5 号菌株（紫芝3）之间的亲缘关系最远。已知紫芝S2 与紫芝2 之间拮抗不明显，而与紫芝3 之间拮抗明显（图1），这2 个试验结果相印证。

2.3 RAPD 和ISSR 引物序列与基因组的比对结果

图3 ISSR -PCR 扩增图谱Fig.3 ISSR-PCR amplifications

图4 紫芝菌株的遗传聚类图Fig.4 Clustering dendrogram of Zizhi strains

将筛选得到5 个引物短序列（标为*_碱基数：S1506_10、S132610、ISSR1-17、ISSR2_17 和ISSR13_14）与紫芝S2 的基因组序列进行Blast 比对，结果发现：除ISSR1_17 外，其他4 个引物都能比对上，均在基因组中不同Scaffold 上的多个位点找到与引物相匹配的序列片段（表2）。在允许一个（单碱基）错配或空位情况下，在18 条Scaffold 上有31 个片段（17 bp）与ISSRPCR 引物ISSR2_17 相匹配（Identity=93.75～94.12），同时在18 条Scaffold 上找到31 个片段（14 bp）与ISSR13_14（完全匹配Identity=100），在48 条Scaffold上找到158 个片段（10 bp）与S1326_10 匹配（Identity=100%），在47 条Scaffold 上找到172 个片段（10 bp）与S1506_10（Identity=100%）相匹配。如不允许错配或空位，则在5 条Scaffold 上有6 个片段（14 bp）与引物ISSR13_14 完全匹配（Identity=100%），在48 条Scaffold 上发现共有158 个片段（10 bp）与引物S1326_10 完全匹配，在47 条Scaffold 上共有172个位点片段（10 碱基）与S1506_10 完全匹配。因此，本研究最终推荐ISSR13、S1326 和S1506 这3 个PCR 引物作为鉴别紫芝菌株的分子标记。

表2 PCR 引物与基因组比对结果Table 2 Blast result of PCR primer sequences on genomes

3 讨论与结论

已知在灵芝属药用真菌的遗传多样性研究中可以通过拮抗反应进行初步分类，然后再通过分子生物学的方法进行深入研究[15～17]。本研究发现，紫芝S2 菌株与其他紫芝菌株之间存在拮抗反应，遗传背景明显不同的个体在菌丝交界区会形成明显的拮抗线，可以据此进行少量紫芝菌株的初步分类与鉴别；但当菌株数量众多时，工作量大且无法量化而不适用。本研究通过筛选到有价值的2～3 个RAPD/ISSR 引物，PCR 扩增得到的DNA 片段呈现条带清晰稳定、多态性和特异性的电泳指纹图谱，可用于紫芝新品种武芝二号（紫芝S2）与其他5 个紫芝菌株的鉴别。在此基础上，通过遗传距离确定其亲缘关系，与菌株间的拮抗反应相一致；进一步通过与紫芝S2 菌株基因组序列比对，确认利用其中3 个引物（ISSR13、S1326 和S1506）作为鉴别紫芝栽培品种或菌株简单有效的分子标记物。

2012 年以来公布的几种灵芝核基因组[18～21]，其中组装质量高和注释信息较完整的有赤芝基因组全序列总长43.29 Mb（82 条Scaffolds, 16 113 个蛋白质编码基因）[19]，紫芝基因组全序列总长48.96 Mb（69条Scaffolds, 15 688 个蛋白质编码基因）[20]；本研究同期完成紫芝S2 三代测序，组装得到的核基因组序列全长56.76 Mb，包含71 条Scaffolds，注释出16 681 蛋白质编码基因（另文报道）。在此基础上，既可以基于灵芝基因组序列筛选出有效SSR 位点用于快捷、准确地标记区分灵芝菌株间亲缘关系（另文报道），也可以将筛选得到的有效鉴别紫芝菌株的RAPD/ISSR-PCR 引物（短序列）与紫芝基因组序列进行Blast 比对验证。

致谢：本研究依托特色食用菌繁育与栽培国家地方（福建省农业科学院）联合工程研究中心、福建农林大学菌物研究中心、福建省农业科学院药用植物研究中心的科研平台完成。