烟草Rubisco分离鉴定及生物信息学分析

王胜优，艾仁丽，孙海峰，谭艾娟

(1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省烟草科学研究所，贵州 贵阳 550003)

Rubisco，全称为1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶，主要存在于叶绿体中，是植物光合作用过程中固定CO2的关键酶[1]。1947年WILDMEN和BONNOR首次发现了Rubisco，直到1965年人们才第1次从菠菜中纯化得到了这个酶[2]。它存在于所有能进行光合作用的生物体内，包括C3,C4植物及藻类等，根据Rubisco大小亚基的组成方式及来源不同，可分为4类(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ型)[3]。Ⅰ型 Rubisco最为常见，由8个相对分子质量为50～55 kD的大亚基和8个相对分子质量为12～18 kD的小亚基组成的十六聚体，相互结合形成双层结构，每一层都含有4个大亚基和4个小亚基，蛋白完整相对分子质量为520～550 kD[4-5]，存在于所有的真核生物、蓝细菌、化能自养及光养的自变菌中。Rubisco占烟草可溶性蛋白的45%～50%。Rubisco含有全部氨基酸，且有的必需氨基酸含量远超FAO/WHO标准。含硒Rubisco抗氧化性极强，高纯度的烟草含硒Rubisco可以作为保健药品开发利用。烟草硒蛋白已经被中国卫健委批准作为医药保健品的添加剂，开发利用烟草蛋白，以此为烟草行业去库存，稳种植，增加烟农收入，进而对促进中国烟草行业可持续发展和产业结构调整均具有重要意义[6-7]。目前，对于Rubisco的提取研究较少，都是以碱溶酸沉法或等电点沉淀法为主，但因为烟草可溶性蛋白种类较多，即使是等电点沉淀法获得的粗蛋白中均含有大量的杂蛋白，导致纯化工艺烦琐、成本过高等，难以工业化应用。关于Rubisco的理化性质研究比较多，但是也仅涉及等电点、溶解性等。关于Rubisco 生物信息学分析少为报道。因此，通过分析烟草Rubisco的生物信息学特性而针对性的设计提取纯化方法变得尤为重要。本研究根据Rubisco具有耐热性使用热沉法提取Rubisco，应用生物信息学的方法对烟草Rubisco的结构、理化性质等进行预测和分析，以期为烟叶Rubisco的多用途开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 云烟87(旺长期烟叶，2019年贵州产，由贵州省烟草科学研究所提供，洗净后沥干多余的水分，储存于-80 ℃超低温冰箱中，蛋白含量3.75%)。

1.1.2 试验试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris 、TEMED(索莱宝生物科技有限公司)，均为分析纯；低相对分子质量蛋白Marker、超高相对分子质量蛋白Marker (购自上海源叶生物科技有限公司)

1.1.3 主要仪器 湖南平凡湘仪离心机，湖南湘仪试验仪器开发有限公司；721N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；定时恒温磁力搅拌器，上海沪西分析仪器厂有限公司；Thermo Scienti Rubiscoc波长酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；试验型冷冻干燥机，上海皓庄有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Rubisco 的粗提取(0～ 4 ℃)、分离 新鲜烟草→加入碱液匀浆、浸提→滤布过滤→硅藻土脱色除杂→热沉→离心→粗蛋白。

称取100 g云烟87叶片，加入预冷的10倍液料比蛋白提取液 (0.05 mol·L-1磷酸缓冲液pH 8.0，1% PVP，0.01 mol·L-1亚硫酸钠)，匀浆后静置匀浆液40 min。硅藻土抽滤除杂后将滤液置于恒温水浴锅中50 ℃保温20 min，冰浴降至室温后，以3 000 r·min-1的转速离心20 min，沉淀即为Rubisco粗蛋白。粗蛋白沉淀用2 mol·L-1氯化钠溶解后，通过凝胶层析柱进行纯化，收集合并蛋白质组分1，冷冻干燥浓缩，储存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 SDS-PAGE电泳 参考文献[8-9]的方法，配制15%分离胶、5%浓缩胶，设置电压为120 V，稳压待溴酚蓝迁移至离凝胶底部2 cm 的位置时停止电泳，染色30 min。脱色直到蛋白条带清晰，以背景脱为无色为终止。通过制作Marker的迁移率标准曲线，测定计算蛋白相对分子质量。

1.2.3 Rubisco蛋白质谱鉴定分析 SDS-PAGE切胶回收，蛋白质的还原烷基化如下：加入终浓度10 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)还原蛋白质，接着加入终浓度55 mmol·L-1碘乙酰胺(IAM)，最后加入1 μg的Trypsin酶，过夜酶解8～16 h。酶解产生的多肽用C 18柱层析除盐，已经除盐的多肽抽干后用15 μL Loading Buffer (0.1%甲酸，3%乙腈)溶解多肽。多肽上LC-MS/MS(ekspertTMnanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus) 仪器进行分析，上机条件参考王土连法[10]。LC-MS/MS下机后，将原始下机数据直接提交到与AB SCIEX Triple TOFTM5600 plus质谱仪连接的Proteinpilot 软件中进行数据库检索。通过NCBI数据库中Blast比对，再次验证是否获得正确的目的蛋白。

通过ProtParam软件对Rubisco的氨基酸组分进行分析，通过ProtParam 软件对Rubisco进行不稳定系数分析，通过Prot Scale对Rubisco的疏水性特征进行预测分析，通过Signal P 5.0 Sever在线分析软件进行信号肽预测，通过TMHMM Server对蛋白的跨膜区域进行预测，通过SOPMA对蛋白的二级结构进行预测分析，通过 SWISS-MODEL对Rubisco的三级结构进行预测分析。

2 结果与分析

2.1 烟草SDS-PAGE电泳

将经过Sephadex G-200纯化后收集组分1进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。每个样品点样2次，孔1，2为购买所得标准品(纯度>95%)，3，4孔为组分1。由图1可见，组分1的大小亚基相对分子质量与标准品相符，通过迁移率标准曲线计算得到，组分1的大小亚基相对分子质量分别为55,13.6 kD，其相对分子质量与标准品接近，推测该组分为Rubisco。图1中样品相对标准品而言的杂带较少且颜色较浅，说明试验纯化所得Rubisco纯度高于标准品纯度的95%[11-12]。

2.2 烟草Rubisco生物信息学分析

2.2.1 烟草Rubisco氨基酸序列比对 对测序获得样品氨基酸序列和NCBI数据库进行Blast比对，纯化后得到的样品大亚基氨基酸亚基序列与数据库中烟草的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)长链氨基酸序列相似度最高为100%；其次，是颠茄中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)长链氨基酸序列相似度为99.79%；纯化后得到的小亚基氨基酸序列与假想蛋白(芽孢杆菌FJAT-21351)基因序列相似度最高，为100%，其次，马铃薯中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小链氨基酸序列相似性为95.00%。烟草中的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小链氨基酸序列相似性为93.68%，小亚基氨基酸序列与数据库对比发现有11个氨基酸缺失或改变。这些序列的不同可能是烟叶品种、烟叶生长环境等造成的差异而导致碱基的突变，使翻译表达的氨基酸不同[13-14]。经过相似度对比，可确定纯化所得即为Rubisco。样品大小亚基与烟草Rubisco(Rubisco)亚基氨基酸序列比对如图2所示。

注：M.低相对分子质量蛋白质Marker；1，2.Rubisco标准品(来源于菠菜，纯度>95%)；3，4.Sephadex G-200纯化的样品。Note：M.Low molecular weight protein Marker;1,2.Rubisco standard product (from Spinach,purity>95%);3,4.Sephadex G-200 purified sample.图1 样品SDS-PAGE电泳图谱Fig.1 Sample SDS-PAGE electropherogram

图2 RbcL和RbcS氨基酸序列Blast比对结果Fig.2 RbcL and RbcS amino acid sequence blast alignment results

2.2.2 烟草Rubisco氨基酸组成分析 通过ProtParam软件对烟草Rubisco的氨基酸组分进行分析，结果如图3。烟草Rubisco含有20 种氨基酸，且8种必需氨基酸的含量都远超联合国粮农组织(FAO)标准，谷氨酸的组成高达7.7%，其金属螯合及质子供体能力有利于增强抗氧化活性。KONG等[15]认为，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸的侧链基团、结构等有利于自由基的结合，从而提高抗氧化活性，烟草Rubisco中仅这3种氨基酸组成占比就高达24.5%。脯氨酸、谷氨酸作为维持蛋白热稳定性的重要蛋白，两种氨基酸含量高达12.7%。因此，分析认为烟草Rubisco具有较高抗氧化活性。

注：*为必需氨基酸。Note:* is an essential amino acid.图3 Rubisco的氨基酸组成Fig.3 Amino acid composition of Rubisco protein

2.2.3 烟草Rubisco不稳定系数分析 通过 ProtParam 软件对烟草Rubisco的大小亚基进行不稳定系数分析，结果如图4所示。大亚基的不稳定系数为38.1，小亚基的不稳定系数为36.75，一般都认为低于40属于稳定性较好，且蛋白的结构与功能是相互适应的，较稳定的结构表明蛋白具有较高的耐热性，较稳定的蛋白结构为提取高活性蛋白奠定基础。

图4 Rubisco大亚基和小亚基的不稳定系数Fig.4 Instability coefficients of Rubisco large and small subunits

2.2.4 烟草Rubisco的亲疏水性预测与分析 通过 Prot Scale预测工具对烟草Rubisco的疏水性特征进行预测分析，结果如图5所示。大于0为疏水性，反之亦然。比较代表疏水峰面积和亲水峰面积的氨基酸所占的百分率，若疏水峰值大于 0 的氨基酸超过氨基酸组成的一半，可以认为由氨基酸合成的整个蛋白质更可能表现出疏水性，反之为亲水性[16]。预测结果显示，Rubisco的亲水峰面积均大于疏水峰，均为亲水性，Rubisco更可能偏为亲水性。这一结果与丁彦蕊等[17]对各家族中高低温3种类别蛋白的氨基酸变化规律进行试验得出的结论相背。他们认为，高温蛋白中疏水性氨基酸的含量要显著高于普通蛋白。这可能与耐高温蛋白同时具有抗氧化特性相关，一般抗氧化蛋白的N端多为疏水性氨基酸，而C端多为亲水性氨基酸。这次预测的各亚基的N端都是疏水性氨基酸(甲硫氨酸)，靠近C端都是亲水性氨基酸(大亚基为赖氨酸、小亚基为酪氨酸)。所以Rubisco受抗氧化和耐高温特性双重影响，蛋白更偏向于亲水性。

图5 Rubisco亲疏水性预测Fig.5 Rubisco hydrophilicity prediction

2.2.5 烟草Rubisco的信号肽预测与分析 通过Signal P 5.0 Sever在线分析软件，分析Rubisco是否具有信号肽，如图6和图7所示。蛋白质可以具有Sec信号肽(Sec/SPⅠ)，脂蛋白信号肽(Sec/SPⅡ)，Tat信号肽(Tat/SPⅠ)或根本没有信号肽(其他)。预测结果显示，大亚基具有SP(Sec/SPⅠ)/LIPO(Sec/SPⅡ)/TAT(Tat/SPⅠ)信号肽的可能性为0.0037，小亚基具有SP(Sec/SPⅠ)/LIPO(Sec/SPⅡ)/TAT(Tat/SPⅠ)信号肽的可能性为0.001 4，因此,Rubisco不具有信号肽序列，不含有信号肽的蛋白,分泌到胞外的可能性很低。如果要分泌到胞外就需要额外添加信号肽。

图6 Rubisco大亚基信号肽预测Fig.6 Rubisco large subunit signal peptide prediction

图7 Rubisco小亚基信号肽预测Fig.7 Rubisco small subunit signal peptide prediction

2.2.6 烟草Rubisco的跨膜区预测与分析 通过 TMHMM Server 对蛋白的跨膜区域进行预测，由图8和图9可知，Rubisco不存在跨膜区域。说明蛋白质合成后就于合成处发挥作用，不存在运输，因此，不可能是分泌蛋白或膜蛋白。还有一种可能，是带有信号肽的前体蛋白到了运输部位跨膜之后，信号肽被切除了，则烟草Rubisco只可能是定位在细胞质基质或细胞器基质中的蛋白。烟草Rubisco是光合作用中固定二氧化碳的关键酶，说明Rubisco应该是存在于叶绿体基质中。烟草Rubisco大亚基是由核基因编码，小亚基为叶绿体基因编码，二者在细胞质中组装成全酶，经跨膜运输到叶绿体内参与卡尔文循环。对蛋白跨膜区域的预测可为提取工艺的选定以及异源表达获取蛋白提供一定的依据[18]。

图8 Rubisco大亚基跨膜区域预测Fig.8 Rubisco large subunit transmembrane region prediction

图9 Rubisco小亚基跨膜区域预测Fig.9 Prediction of Rubisco small subunit transmembrane region

2.2.7 烟草Rubisco的二级结构预测与分析 通过 SOPMA 对蛋白的二级结构进行预测，结果如图10所示。大亚基参与构成β转角的氨基酸为105.45%，小亚基为2.78%，小亚基的无规则卷曲为48.89%，大亚基为35.64%，小亚基的α-螺旋占比为44.23%，比大亚基含有的α-螺旋占比28.33%要多。此外，螺旋结构集中靠近肽链的N末端或者C末端，这样有利于提高蛋白的耐热性。α-螺旋形成大量的偶极子，偶极子通过与N末端的带负电的残基或C末端带正电的残基相互作用来提高蛋白的稳定性[19]。

图10 Rubisco大亚基和小亚基二级结构预测Fig.10 Prediction of the secondary structure of Rubisco large and small subunits

2.2.8 烟草Rubisco的三级结构预测与分析 通过 SWISS-MODEL对Rubisco的三级结构进行预测，结果如图11所示。在预测结构中Rubisco是由大小亚基各8个组成的超高相对分子质量十六聚体，其三级结构形成需要8个帽子结构、8个Mg2+作为配体，每个帽子结构与22个残基连接，连接16～17个褶皱的交互作用。每个Mg2+与6～7个残基连接，参与连接2个褶皱的交互作用。预测显示每个FI蛋白需要8个Mg2+作为配体连接残基。若蛋白需要在体外活化，则需要考虑Mg2+的添加。

图11 Rubisco 3D 结构预测Fig.11 Rubisco 3D structure prediction

3 结论与讨论

热沉法得到的组分1通过SDS-PAGE及蛋白质谱测序可证实其确为Rubisco。Rubisco含有人体所需的全部8种必需氨基酸和10种非必需氨基酸，属于优质蛋白。但是，在对蛋白的氨基酸组成分析中发现，本试验的某些氨基酸的含量低于KUNG等[20]的研究结果，而有些氨基酸含量高于后者，与郭培国等[21]的方法得到的氨基酸含量也有差异。推测可能是因为KUNG等用于测定氨基酸含量的是蛋白晶体纯度较高，且烟叶品种、烟叶生长环境等也会导致差异的产生，甚至是基因序列的改变，所以表达的氨基酸也会存在差异。从营养的角度来看，蛋白的营养价值取决于氨基酸的组成及比例，尤其是必需氨基酸的组成及比例。联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)的蛋白评分模式指出，必需氨基酸(EAA)/总氨基酸(AA)的比值在40%左右为优质蛋白，而Rubisco的评分为40.7%，已经达到该标准。

Rubisco稳定性高且为亲水性蛋白，不存在信号肽及跨膜区域，说明可考虑使用异源表达的方式获取蛋白，但是需要额外添加信号肽序列。余方伟等[22]和薛楠等[23]认为α-螺旋是二级结构中最为稳定的结构，这种结构有利于蛋白耐热性的提高，而Rubisco的大小亚基中该结构的占比都是最多的，尤其是小亚基甚至达到44.23%，所以通过对蛋白质谱结果进行分析，推测Rubisco应该具有较高的耐热性，且具有一定的抗氧化活性，这两种性质并未叠加，而是相互影响直至达到一种平衡状态，从而使得Rubisco具有独特性。因此，在蛋白提取试验中可针对蛋白的耐热性选择热沉法沉淀提取蛋白，可有效降低杂蛋白的干扰。对蛋白的疏水性分析结果显示，Rubisco偏亲水性且具有抗氧化蛋白的显著特性，二级结构预测也显示出蛋白具有较高的耐热性。蛋白中的三级结构预测图与Manajit Hayer-Hartl的大亚基结构一致性为100%，小亚基为89.80%，说明建模预测具有较高可靠性，其小亚基存在的差异可能是种属来源及建模数据库不同造成的。