顶空固相微萃取-气质联用分析不同发酵方式蓝莓酒的香气物质成分及特征

国 田，夏晓雨，张 娜，柴洋洋，郭庆启，3

（1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；）

蓝莓为杜鹃花科Ericaceae 越橘属Vaccinium植物，是新兴的木本小浆果类保健果树，主要分布在我国的长白山及大小兴安岭林区。蓝莓含有丰富的营养成分，具有良好的营养保健功能和较高的经济价值和广阔的开发前景[1]，除维生素A、维生素C、果糖和膳食纤维外，更富含原花青素、花青素、鞣花酸、叶酸等酚类物质，使蓝莓具有多种生理活性功能，如抗氧化、提高免疫力以及改善夜视等功效，被认为是膳食结构中抗氧化剂的最佳来源之一，也是一种经济价值极高的新兴小浆果树种[2-3]。野生蓝莓因其口感较酸而不宜鲜食，且不耐运输和贮存，因此常被制成各种易于贮存的加工品，如果汁、果酒、蓝莓果酱等产品，以及高级化妆品和医疗保健品的原材料[4]。随着消费者对食品功能性和营养性关注度的提升，蓝莓及其加工品作为极具保健价值的功能性食品而备受关注。

蓝莓酒是一种以蓝莓为主要原料，经酵母发酵、酿造而成的深加工产品，富含酚类化合物、醇酯、原花青素等多种功能性因子[5]。因其具有独特的醇和口感、较高的营养价值和抗氧化能力而备受科研人员的关注和消费者的喜爱。标准的蓝莓酒色泽应呈现宝石红色，酒体清亮无浑浊，蓝莓酒的香气应既具有天然蓝莓果香，也含有发酵而来的浓厚醇香。蓝莓酒的香气和口感决定了产品的感官评价和风格，是衡量蓝莓酒品质的重要指标之一。固相微萃取-气相色谱-质谱（SPMEGC-MS）联用技术是研究食品中挥发性香气物质常用的有效手段。GC-MS 技术具有检测灵敏度高、操作快速、结果准确等特点，而且有标准质谱库可供检索，是定性和定量的优良手段。目前，国内外关于蓝莓酒的研究大多集中在蓝莓酒酿造工艺、蓝莓酒营养及抗氧化功能、蓝莓酒营养成分提取及稳定性研究等方面[6-8]。关于蓝莓酒香气成分方面的研究也主要集中在不同酵母、不同品种和发酵工艺的优化等方面[9-11]，对蓝莓酒香气物质的研究较少，尤其是不同发酵方式对蓝莓酒香气影响的研究鲜见报道。在发酵果酒的酿造过程中，浸渍工艺主要决定了原料浆果中的香气和酚类物质进入酒体中的含量，浸渍的关键在于选择浸出花青素和优质单宁，而不浸出或少浸出带有苦味和生青味的劣质单宁，因此出现了不同温度形式的浸渍方式。对比传统的带渣发酵工艺，发酵前期的冷浸渍有利于提高果香浓郁度，热处理则有利于提高产品的口感结构，达到改善果酒风味的目的[12]。因此本研究选用低温预浸渍发酵、热浸渍和带渣发酵3 种常见的蓝莓酒发酵工艺技术，对不同发酵方式所制得的蓝莓酒采用固相微萃取和气谱-质谱联用技术分析测定发酵前后的香气物质成分和含量，比较不同发酵方式对蓝莓酒发酵香气的影响，分析各香气成分对果酒香型特征风格的影响，为蓝莓酒发酵方式的选择及加工提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要原料与试剂

野生蓝莓Vaccinium uliginosum冻果购自大兴安岭超越野生浆果开发有限公司，-18℃冻藏；果胶酶：食品级，酶活力50 000 U·g-1，和氏璧生物科技有限公司；高活性干葡萄酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；所用化学试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

EL20 梅特勒-托利多pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JYZ-C500 九阳榨汁机，九阳股份有限公司；GZX 型恒温培养箱，金坛市万华实验仪器厂；6890-MS 5973N 型气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司；顶空固相微萃取装置，手动进样手柄，50/30 μmDVB/CAR/PDMS 萃取纤维，美国Supleco 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 不同发酵方式的蓝莓酒的制作

酶解：果胶酶用量0.25%，50 ℃，2 h。

成分调整：白砂糖调整糖度至20° Birx，CaCO3等调节酸度至3.4，K2S2O5添加量0.01 g/L。

1.2.2 香气成分分析检测方法

采用HS-SPME-GC-MS 对3 种工艺所制得的蓝莓酒的挥发性风味物质进行检测[13]。

顶空固相微萃取条件：取约20.0 mL 样品加入40 mL 样品瓶中，将样品瓶放入60 ℃的水浴中平衡10 min，将老化好（老化时间：5 min）的萃取针头插入样品瓶中，将石英纤维头暴露于样品瓶的顶空气体中，恒温60 ℃萃取30 min，用手柄将纤维头推回针头内拔出，插入GC-MS 的进样器于250 ℃条件下解析1 min，同时启动仪器采集数据。

色谱条件：进样口温度250 ℃，载气He，流速1.0 mL/min。采用程序升温方式，由室温升至80 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min 升至230 ℃，在此温度下保持13 min。

质谱条件：MS 离子源在225 ℃全扫描，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围 50～500 amu。

2 结果与分析

2.1 3 种发酵工艺蓝莓酒中香气物质的测定结果

对低温预浸渍、热浸渍和带渣3 种发酵方式制备的蓝莓酒进行挥发性成分测定，结果如表1～3所示。

2.2 3 种发酵工艺蓝莓酒中香气物质的种类与含量分析

由表1～4 可知，无论采用哪种发酵方式，蓝莓果汁经发酵所制得的蓝莓酒中香气物质的种类都要高于发酵之前的蓝莓果汁；且经过发酵之后，酒中酯类和酸类物质种类都有了明显的增加。曹雪丹等[14]在对比了蓝莓酒主发酵前后挥发性成分变化后发现，蓝莓酒主发酵前后挥发性成分的种类和构成变化较大，由36 种增加到46 种。

3 种发酵方式中高温预浸渍发酵后酒中主要香气物质的种类最多，为39 种，高于低温预浸渍发酵的36 种和带渣发酵的31 种，推测发酵前70 ℃温度的预处理更有利于发酵体系中微生物和酶的作用，在发酵过程中代谢和产生了更多的香气类物质。王菁等[15]在不同制作工艺对欧李果酒品质比较中，在熟汁发酵酒中测出35 种挥发性成分，醇类和羧酸类化合物减少，但酯类化合物大大升高，可能是因为热处理加速了酯化反应的进行。

由表5可知，3 种工艺发酵前的蓝莓果汁中香气物质含量分别为67.28%、56.71%和55.40%，而经过低温预浸渍、热浸渍和带渣发酵工艺制备蓝莓酒后，香气物质含量分别为94.02%、91.58%和83.52%，香气物质含量都有了明显的提升，这其中以热浸渍发酵工艺方式提升最为显著。陈娟等[16]在研究3 种猕猴桃酒在发酵过程中挥发性香气成分的变化中对比了原汁和发酵5、12 和19 d猕猴桃酒的香气成分，发酵后的猕猴桃酒中的香气种类和成分都要高于原汁。姜永超等[17]在不同酿酒酵母对菠萝果汁发酵特性的比较中，对菠萝果汁以及不同酵母发酵的菠萝果酒进行风味物质的检测，果汁中共鉴定出15 种化合物香气物质，共占挥发性成分的29.66%；果汁经过发酵后各类挥发性成分所占比重发生较大的变化，香气物质的组成和含量均有明显增加。不同酵母发酵的果酒中香气物质种类有22～27 种，含量占其挥发性成分的76.24%～90.88%。酵母代谢是产生果酒香气的途径之一。这些研究表明，在酵母菌的发酵作用下，发酵原汁中的风味前体物质转化成了各种丰富的挥发性香气成分，使果酒比果汁拥有更丰富的香气物质。

表1 低温预浸渍发酵方式所得蓝莓酒中的主要挥发性成分Table 1 Major volatile components of blueberry wine by low temperature pre-impregnated fermentation mode

表2 热浸渍发酵方式所得蓝莓酒中的主要挥发性成分Table 2 Major volatile components of blueberry wine by hot impregnated fermentation mode

表3 带渣发酵方式所得蓝莓酒中的主要挥发性成分Table 3 Major volatile components of blueberry wine by slag fermentation mode

续表3Continuation of table 3

表4 3 种酿造方式蓝莓酒发酵前后主要香气成分统计Table 4 Statistics of main aroma components of blueberry wine by three brewing modes

表5 3 种酿造方法蓝莓酒发酵前后主要香气含量Table 5 Main aroma content of blueberry wine before and after fermentation with three brewing modes %

3 结论与讨论

3.1 3 种发酵工艺蓝莓酒中香气物质分析

3.1.1 醇类物质的比较分析

醇类化合物是酵母通过糖分解代谢或脱羧反应和氨基酸的脱氨基作用形成的代谢产物[18]，适宜浓度可衬托酯香，促进香气的协调性，是果酒中重要的香气物质。3 种酿造方式发酵前后共检测出9 种醇类物质，发酵前共有的醇类物质有3 种，分别是乙醇、苯乙醇和4-萜烯醇。带渣发酵后所含醇类化合物种类最多，有7 种，低温预浸渍发酵前后共检测出醇类物质4 种，而热浸渍最少，为3 种。带渣发酵酒醇类含量最高（36.69%），其次是低温预浸渍发酵酒（19.64%），热浸渍发酵酒最低（14.39%）。3 种发酵工艺都促进了苯乙醇含量的增加，尤其以低温预浸渍和带渣发酵2种工艺增加更为显著。

苯乙醇是蓝莓酒重要的呈香物质之一，具有花香味呈清淡的玫瑰香气，它主要存在于茉莉等植物的精油中，在低浓度下也可以产生很浓烈的玫瑰香味，所以低温预浸渍发酵更赋予了蓝莓酒较浓郁的花香风味[19]。带渣发酵酒中醇类物质较多，其中3-甲基-1-丁醇、1-己醇具有植物香气，正戊醇略带果香，而异丁醇具有酒精味、指甲油的香味[20]，可能是由于果渣中底物种类的多样性，在发酵过程中产生了更多的醇类物质。

3.1.2 酯类物质的比较分析

酯类主要来源于果实和酒精发酵，具有水果香气，是对酒香气有很大影响的一类呈发酵香化合物[21]。酯类化合物相对含量在整体挥发性物质中的比例最大，是构成果酒香气的重要物质，对果酒的主体香型及风格具有重要的影响[22]。3 种酿造方式发酵前后共检出酯类34 种，共有的5 种酯类分别为己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和棕榈酸乙酯。

低温预浸渍和热浸渍发酵前后酯类化合物种类基本相同，带渣发酵前后酯类化合物种类与其他两种差异较大。低温预浸渍和热浸渍发酵前后分别检出21 种和24 种酯类化合物且含量最高的均为癸酸乙酯，分别为20.39%和16.55%；带渣发酵前后检出酯类物质14 种，含量最高为辛酸乙酯9.15%，低温预浸渍和热浸渍发酵后的酯类物质种类要多于带渣发酵。乙酸乙酯具有果香味，是蓝莓果酒香气的重要构成成分，可以协调苦涩味，令酒香醇厚，是反映果酒风味优劣的重要物质。低温预浸渍和热浸渍中的月桂酸乙酯有甜橙和葡萄的香味；癸酸乙酯具有葡萄香气，低温预浸渍发酵酒中癸酸乙酯含量最高，而辛酸乙酯具有白兰地酒香味，都是柔和、愉快而持久的香气成分，具有玫瑰花香、橙子果香。

袁晓红等[23]对低温预浸渍发酵的蓝莓酒进行香气成分分析时也发现辛酸乙酯和癸酸乙酯经16℃预发酵后含量明显高于25℃发酵，说明16℃发酵更适合蓝莓酒风味酯类物质的富集。Molina等[24]对葡萄酒中的挥发性物质进行温度对其影响的研究时发现，乙酸乙酯在低温条件下的含量是高温条件下的4 倍，辛酸乙酯在低温条件下的含量是高温条件下的3.5～4.0 倍。乙酸异戊酯具有似香蕉味、梨的酸甜味[25]，甲酸异戊酯有特殊的香蕉和李子的香甜气[26]，丁酸乙酯具有强烈的似菠萝、香蕉的甜果香气，发酵后3 种工艺中热浸渍发酵工艺棕榈酸乙酯的含量最高，呈微弱奶油香气，棕榈酸甲酯呈微弱蜡香和奶油香气，亚油酸乙酯具有降低血液中胆固醇和血脂的作用。

3.1.3 酸类物质的比较分析

脂肪酸类物质在浓度较低时呈奶油和奶酪香，浓度太高则会产生酸涩味和腐臭味[27]，其可与醇类物质发生发应，形成酯类，使酒体香气更加协调、平衡[28]。低温预浸渍和热浸渍发酵后均检出5 种酸类物质，带渣发酵检出4 种酸类物质。3 种发酵方式共有的酸类物质有2 种，分别为辛酸和癸酸；此外，在低温预浸渍和热浸渍发酵后癸酸含量最高，癸酸具有愉快的脂肪气味，辛酸作为关键挥发性香气，在低浓度时散出类似奶酪和奶油的风味[29]。低温预浸渍和热浸渍中的月桂酸使得酒体具有坚果和月桂油香气[30]。

3.1.4 其他物质的比较分析

低温预浸渍和热浸渍发酵前后都不含有醛类化合物，只有带渣发酵前后含有。有研究表明，醛类物质在果酒酿造过程中逐渐发生转化[31]，主要是发酵过程中，醛类物质十分不稳定，进一步氧化酯化形成了更加稳定的其他物质[32]。醛酮类物质常具有特殊的香气，同时能使酒体香气趋于融合。带渣发酵含有的苯乙酮具有水果香气，癸醛呈新鲜的油脂香，2-壬酮呈水果、花、油脂、芸香和药草香气。萜烯类广泛存在于浆果中，果实中的糖苷结合态萜类可以在酶解或酸解的作用下形成游离态的萜类芳香成分，从而增强果酒的风味[13]。这些萜烯类组分虽然相对含量低，但其香气值很高，是蓝莓酒形成浓郁香气中不可忽视的因素，其中D-柠檬烯具有似橙香气。

3 种酿造方式中，低温预浸渍和热浸渍在挥发性物质的种类和含量上差异较小，共有的挥发性物质很多，且3 种酿造方式蓝莓酒发酵后的挥发性物质种类和含量均高于发酵前，发酵后的杂环类化合物减少，产生多种醇类和酯类化合物。黄婷等[33]运用气质联用鉴定出蓝莓酒中的54 种香气物质，主要的醇类物质为2,3-丁二醇和异戊醇。曹雪丹等[14]测定蓝莓酒主发酵前后的挥发性成分时发现，完成蓝莓酒由果汁到果酒的主要香气变化的阶段是主发酵，主发酵前后挥发性成分的种类由36 种增至46 种。低温预浸渍发酵后挥发性物质含量最高，醇类和酯类总含量最高80.24%，且苯乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯这4 种特征性香气物质在低温预浸渍发酵后相对含量最高达到32.35%。说明低温预浸渍发酵方式赋予蓝莓酒更浓郁的香气。热浸渍发酵后的香气种类最多，酯类香气物质最多达到24 种，相对含量最高为63.07%，但是醇类和酯类挥发性物质总相对含量比低温预浸渍低。带渣发酵与其他两种酿造方式的挥发性物质种类差异很大，只有带渣发酵后含有醛类、酮类和萜烯类。这体现出果皮、果肉在果酒香气形成中的某些作用，在发酵后使果渣中的香气成分充分浸渍出来丰富果香和酒香，但是带渣发酵后的香气种类和含量都是3 种发酵方式中最少的[34]。因此，对比3 种发酵方式的香气物质种类、相对含量以及特征性香气含量等方面，以低温预浸渍发酵所制得的蓝莓酒的风味品质为最佳。

3.2 结 论

SPME 对发酵蓝莓酒中主要挥发性物质能够很好地吸附，与传统的香气成分含量测定的方法相比具有快速、灵敏、不需要溶剂等优点。将SPME与GC-MS 联用能够较好地分析蓝莓酒中挥发性的风味物质，测定结果表明发酵蓝莓酒具有较丰富的挥发性风味物质组成，香气物质种类由高到低依次为酯类＞烷类＞醇类＞酸类＞苯环类，总含量从高到低依次为酯类＞醇类＞酸类＞烷类＞苯环类；特征性的香气物质主要有苯乙醇、乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸、癸酸、2-壬酮、D-柠檬烯等。对比3 种发酵方式，低温预浸渍发酵的蓝莓酒挥发性物质、醇类和酯类以及特征性香气物质的相对含量最高，低温预浸渍发酵的蓝莓酒风味品质最佳。研究结果表明利用GC-MS 结合SPME 技术对不同发酵工艺蓝莓酒香气特征进行综合评价和分析，可以为蓝莓酒发酵工艺的选择及其香气品质的分析、调控和提升提供理论依据。

蓝莓酒的香气物质不仅受发酵条件的影响，还与原料的品种和产地的环境因素等条件有关，同时由于中国传统的酒文化，使得人们在饮用发酵酒的时候，不仅能带来口感上的享受，还能带来舒爽惬意的感觉，而这些感官评价只能通过专业人员的品尝来鉴定，无论多么先进的仪器都不能取代感官评价分析，因此后续要进一步分析不同品种、产地和发酵年份之间的蓝莓酒香气物质以及建立产品的感官评价和指纹图谱，研究蓝莓酒香气特征形成的机制。