2016—2019 年我国I 类新城疫病原学监测与遗传进化分析

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus），为单股负链RNA 病毒，可感染240 多种禽类。NDV 只有1 个血清型，但可分为多种基因型。根据病毒F基因序列差异，毒株可分为I 类（class I）和II 类（class II）两大类。II 类NDV 流行时间较长，至少包括21 种基因型。历史上引起5 次ND 大流行的毒株和常用疫苗株均属于II 类NDV[1]。I 类NDV 只有1 个基因型，但可细分为3 个基因亚型[1]。2003 年I 类NDV 在法国野生麻鸭中被首次分离到，此后又出现于野生水禽和野鸟中，近年来又传播至家禽[2-4]。2008 年通过病毒分离，我国首次证实I 类NDV 的存在，随后研究发现病毒已在我国广泛流行[5-6]。回顾性调查发现，2002 年在浙江、福建等地活禽市场检出的病毒与其同类，说明I 类NDV 早已存在[7]。虽然I 类NDV 绝大多数为无毒株或弱毒株，但已有学者证实NDV 弱毒株可通过鸡或鸡胚连续传代增强毒力[8-11]。我国养禽业发达，I 类NDV 污染面广[12]且存在基因变异和毒力增强的风险。因此，对国内家禽中携带的I 类NDV 进行长期系统监测，掌握病毒分布和流行规律，对新城疫防控具有重要意义。本研究于2016—2019 年，按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，在我国23 个省（自治区、直辖市）998 个采样点，随机采集家禽口咽/泄殖腔双拭子样本、野鸟粪便样本和环境样本，通过病毒分离和常规RT-PCR 技术检测I 类NDV，并对分离株进行遗传进化分析，以期为科学防控新城疫提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本与鸡胚

从国内23 个省（自治区、直辖市）的批发市场、农贸市场、养殖场和屠宰场，随机采集不同种类家禽的口咽/泄殖腔双拭子样品和环境样品，并在野鸟栖息地采集野鸟粪便样品。SPF 鸡胚，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 病毒分离鉴定

按照国标《新城疫诊断技术》（GB16550—2008）规定方法，将采集的样品接种9～11 日龄SPF 鸡胚。每个样品接种2 枚鸡胚，37 ℃孵育，弃掉24 h 内死胚；96 h 后，收获鸡胚尿囊液，进行血凝（HA）、血凝抑制（HI）试验；分装鉴定为NDV 阳性的尿囊液，-80 ℃保存。

1.3 RNA 提取

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，将提取的RNA 立即用于RT-PCR 扩增或者于-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 鉴定

采用本实验室建立的RT-PCR 方法[13]，利用Hiscript High Fidelity One Step RT-PCR Kit（Vazyme）扩增病毒F基因。引物序列见表1。RT-PCR 反应条件为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 30 s，进行35 个循环；72 ℃ 6 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品送青岛睿博兴科生物技术有限公司测序。

表1 I 类NDV 鉴定引物

1.5 遗传进化分析

利用MEGA 6 软件，对毒株F基因序列进行系统进化分析；采用邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树。

2 结果

2.1 I 类NDV 监测

2016—2019 年，按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，在安徽、江苏、上海等23个省（自治区、直辖市）开展了新城疫病原学主动监测，在998 个采样点共采集家禽口咽/泄殖腔拭子、野鸟粪便样本和环境样本45 458 份，经病毒分离、RT-PCR 鉴定和序列测定，共分离到I类NDV 558 株，病毒阳性率为1.23%（95%CI，1.13%～1.33%）。其中，2018年I类NDV阳性率最高，为1.88%（表2）。558 株病毒主要来源于鸡（403株）和鸭（126 株），少量来自鹅、鸽和环境样本（表3）。野鸟粪便样本中未检测到病毒。

2016—2019 年分离的558 株I 类NDV 来源于安徽、福建、广东、广西、贵州、湖北、江苏、江西、宁夏、上海、四川、云南、西藏、青海、新疆和浙江等16 个省（自治区、直辖市）的127 个采样点，主要分布于我国华东、西南和西北地区，其中，广东、广西、江苏、江西、宁夏、上海、云南等地连续4 年分离到I 类NDV。监测到I 类NDV 的127 个采样点包括，31 个活禽批发市场、91 个农贸市场、3 个养殖场和2 个屠宰场。活禽批发市场和农贸市场年均病毒阳性率分别为28.70%和24.33%（图1），明显高于养殖场和屠宰场（P＜0.05）。

表2 2016—2019 年I 类NDV 主动监测病原学检测结果

2.2 I 类NDV 遗传进化分析

遗传进化分析结果（图2）显示：2016—2019年分离的558 株I 类NDV 分属于2 种基因亚型：1.1.2 亚型551 株、1.2 亚型7 株。其中，1.1.2 亚型为目前我国家禽中流行的优势基因亚型，在我国16 个省（自治区、直辖市）家禽中均分离到；1.2基因亚型均为鸭源分离株，分别于2016 年和2018年分离自宁夏、江苏和广西等地。

3 讨论

图1 不同采样点I 类NDV 阳性率分布

表3 2016—2019 年I 类NDV 宿主分布

图2 2016—2019 年I 类NDV F 基因进化树

1926 年3 月，印度尼西亚在爪哇岛首次发现新城疫，随后英格兰、朝鲜、印度、斯里兰卡、菲律宾、日本和澳大利亚等国也相继报道发生新城疫。迄今为止，该病已蔓延至世界各地，给养禽业造成严重危害。毒株遗传进化分析结果显示，NDV 可分为I 类、II 类两大类[14]。I 类NDV 出现较晚，2003 年首次在法国野生麻鸭中分离到，早期主要存在于野生水禽和野鸟中，随后在活禽市场家禽中被陆续分离到[2-4]。早期基因分型方法将I 类NDV分为至少10 个基因型[2]，国内流行毒株主要为基因2 型 和3 型[7，12]。2012 年，Diel 等[14]将I 类NDV 合并为1 个基因型，但细分为3 个基因亚型（1a、1b 和1c）。我国流行毒株主要为基因1b 亚型。2019 年，全球9 家OIE 新城疫参考实验室联合20 家国际著名实验室更新了NDV 分类方法，将I 类NDV 划分为1 个基因型3 个基因亚型（1.1.1、1.1.2 和1.2）[1]。我国早期分离株属于1.1.1 和1.2基因亚型[5-6]。2016—2019 年我国分离的I 类NDV主要为1.1.2 基因亚型，只有7 株病毒属于1.2 基因亚型。序列分析结果显示，2016 年我国宁夏和江苏分离的6 株1.2 基因亚型毒株与北美野生水鸟分离株高度同源。此类病毒于2015 年首次出现于我国广西鸭群，但由于缺乏周边国家新城疫监测数据，至今仍不清楚该毒株的确切来源[15]。

我国I 类NDV 污染面广。2016—2019 年我国16 个省（自治区、直辖市）127 个采样点均分离到I 类NDV。2011—2015 年监测数据表明，I类NDV 主要分布于我国华东、华中、华南和西南等东部和南部地区[12]。本研究结果显示，近年来I类NDV 主要分离自我国华东、西南和西北地区，暗示病毒正逐渐从我国东部和南部向西部蔓延。活禽批发市场和农贸市场是I类NDV的高污染场点。本研究在活禽市场的鸡、鸭、鹅、鸽等家禽和环境样本中均分离到I 类NDV。部分活禽市场中，家禽免疫情况不明，多种禽类混养，市场卫生条件较差，这些因素极易导致病毒传播。因此，应加强活禽市场的生物安全管理，积极采取消毒、休市等措施。2017—2018 年，本研究在少数养殖场中也分离到I 类NDV。I 类NDV 虽为弱毒株，使感染鸡不表现明显临床症状，但在鸡体内连续传代后，可能通过基因变异增强毒力。因此，在家禽饲养过程中，应制定科学的免疫程序，做好疫苗免疫和抗体监测，同时加强饲养管理，改善养殖环境，提高家禽抵抗力，降低病毒感染、变异和传播的风险。

4 结论

本研究发现，我国I 类NDV 污染面广，宿主范围广泛，且存在2 种基因亚型。建议加强饲养家禽I 类NDV 的免疫、监测，同时加强饲养管理，提高家禽抵抗力，降低病毒基因变异使毒力增强的风险。