响应面法优化超声辅助提取浙贝母蒽醌工艺及其抑菌活性研究

侯敏娜，侯少平，刘艳红，王 珊，许海燕

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)是多年生草本植物，鳞茎是药用部位[1,2]，产于四川、云南、浙江、陕西、甘肃等地[3,4]。该植物具有清热化痰、散结解毒之功效，可用于治疗风热咳嗽、肺痈喉痹、瘰疬、疮疡肿毒等症。现代药理研究证实，浙贝母具有镇咳、祛痰、松弛气管平滑肌、镇痛抗炎、降压、抑菌、活血化瘀、抗溃疡、止泻等作用[5-9]。

在2020年全国抗击新冠肺炎的中西药结合治疗中，浙贝母是中药配方中组成药味之一，其为止咳良药，含有多种化学成分，活性成分以生物碱和皂苷类为主。多数植物药中蒽醌类成分具有很好的抑菌活性[10.11]，然未见浙贝母药材在这方面的报道。因此，本研究尝试从浙贝母中提取蒽醌类成分，并对其抑菌活性进行检测研究，以期为浙贝母药材抑菌活性的相关研究及其临床合理、有效利用提供可靠的参考依据。

目前，蒽醌类成分的提取方法常有：溶剂提取法、超声提取法、微波提取法和CO2超临界流体萃取法等，本研究利用响应面法优化超声提取浙贝母蒽醌工艺。超声提取法具有提取温度低、效率高、省溶剂、时间短等独特优势，是从中药提取有效成分的一种高效、节能、环保式的现代技术手段。响应面设计法(Response Surface Methodology，简称RSM)，是利用合理的试验设计方案并通过实验得到的数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的数学函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法与正交设计法、均匀设计法相比较，既保留了正交设计和均匀设计实验次数少的优点，又具有直观、高效、方便及可在较短时间内对所选试验各参数进行全面研究等特点[12-14]。所以本研究采用方法所获得的实验结果具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浙贝母(购于陕西康宇制药有限公司，经我院中药教研室雷国莲教授鉴定，为百合科植物浙贝母的干燥鳞茎)；1，8-二羟基蒽醌对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：110829-9702)；金黄色葡萄球菌(南京乐诊生物技术有限公司)；大肠杆菌(南京乐诊生物技术有限公司)；无水乙醇(天津市河红区红岩试剂厂)等，其余试剂均为市售分析纯。

TU-1810紫外-可见分光光度计(上海长城制造有限公司)；KQ5200DE超声波提取器(江苏省昆山市淀山湖镇)；TDL-60B高速离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；SHZ-D循环水式多用真空泵(李仓区恒通兴达仪器仪表商行)；KQ-A玻璃仪器气流烘干器(北京中兴伟业仪器有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取于105 ℃干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌对照品2.65 mg，置于25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，即可制得标准溶液(浓度为0.106 mg/mL)。

分别精密移取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于25 mL量瓶中，加入1%的醋酸镁显色剂 2.5 mL，摇匀，使其充分混合，显色30 min，用95%乙醇定容至刻度，摇匀。用紫外-可见分光光度计在波长506 nm处测其吸光度。以吸光度A(y)为纵坐标，浓度C(x)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，在0.0008～0.0048 mg/mL范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系(图1)。

图1 1，8-二羟基蒽醌标准曲线

1.2.2 提取方法 准确称取经干燥、粉碎后的浙贝母粉末2.000 g，置于具塞锥形瓶中，加入乙醇适量，超声提取，过滤，滤液离心(3000 r/min，15 min)。按 1.2.1方法处理样品后，用95%乙醇定容至刻度，摇匀。在波长506 nm处测其吸光度[15-18]，根据以下公式计算浙贝母蒽醌的提取率(Y)。

Y=C×V×D×10-3/M×100%

(1)

其中：C代表溶液浓度(mg/mL)；V代表溶液的体积(mL)；D代表稀释倍数；M代表浙贝母粉末的质量(g)。

1.2.3 单因素考察[19-21]

1.2.3.1 提取时间对浙贝母蒽醌提取率的影响 按照1.2.2 浙贝母蒽醌提取方法，当超声功率设定为100 W，超声温度恒定65 ℃，料液比为1∶30 g/mL时，考察提取时间(10、15、20、25、30 min)对浙贝母蒽醌提取率(Y)的影响。

12.3.2 乙醇浓度对浙贝母蒽醌提取率的影响 按照1.2.2浙贝母蒽醌提取方法，在超声功率设定为100 W，超声温度恒定65 ℃，料液比为1∶30 g/mL，提取时间为20 min时，考察乙醇浓度(70%、75%、80%、85%、90%)对浙贝母蒽醌提取率(Y)的影响。

1.2.3.3 料液比对浙贝母蒽醌提取率的影响 按照1.2.2浙贝母蒽醌提取方法，在超声功率设定为100 W，超声温度恒定65 ℃，料液比为1∶30 g/mL，提取时间为20 min，乙醇浓度为75%时，考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)对浙贝母蒽醌提取率(Y)的影响。

1.2.4 响应面实验优化 根据Box-Benhnken中心组合的方法，结合单因素试验结果，以浙贝母总蒽醌的提取率为响应值(Y)，选取提取时间(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)3个对提取率影响较大的因素，各因素分别用-1、0和1表示低、中、高3个水平，设计三因素三水平的响应面分析实验(表1)。

表1 实验因素水平设计

1.2.5 数据处理 使用Design- Expert 8.0.6软件对数据进行分析。

1.2.6 浙贝母蒽醌抑菌活性研究[22-25]

1.2.6.1 样品制备 将从浙贝母中提取得到的蒽醌分别配制成浓度为2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL的4个梯度溶液，用滤膜过滤后，置冰箱中冷藏备用。

1.2.6.2 牛津杯法抑菌实验 将已灭菌的琼脂培养基加热至完全融化，倒入培养皿内，每皿15 mL，待凝固。将菌悬液用移液枪移入培养皿中，涂布于培养基上，将牛津杯垂直放置于培养基上，每个培养皿中均匀放置4个牛津杯，向牛津杯中加入上述样品溶液，于37 ℃培养箱中培养18 h，测量抑菌圈直径。以无机盐NaCl为阴性对照，抑菌圈愈大，说明抑菌效果愈好。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取时间对浙贝母蒽醌提取率的影响 由图2可知，当提取时间为20 min时，浙贝母蒽醌的提取率达最高。当提取时间小于20 min时，浙贝母蒽醌提取率呈明显上升趋势；当提取时间超过20 min时，其呈直线下降趋势。可能是由于当提取时间较长时，浙贝母蒽醌分子在超声波的剪切作用下发生破坏或分解，从而影响了提取率。故提取时间为20 min时浙贝母蒽醌的提取率最佳。

图2 提取时间对浙贝母蒽醌提取率的影响

2.1.2 乙醇浓度对浙贝母蒽醌提取率的影响 乙醇浓度对浙贝母蒽醌提取率的影响结果见图3。由图3可知，当乙醇浓度为75%时，浙贝母蒽醌的提取率达最高。当乙醇浓度低于75%时，浙贝母蒽醌提取率呈明显上升趋势；当乙醇浓度超过了75%时，其呈现较为明显的下降趋势。原因可能是当乙醇浓度增大时，其会使一小部分脂溶性杂质如叶绿素、油脂等溶出，阻碍了蒽醌的溶出，使其提取率降低。故乙醇浓度为75%时浙贝母蒽醌的提取率最佳。

图3 乙醇浓度对浙贝母蒽醌提取率的影响

2.1.3 料液比对浙贝母蒽醌提取率的影响 料液比对浙贝母蒽醌提取率的影响结果见图4。由图4可知，当料液比小于1∶25 g/mL时，随着溶剂用量增加浙贝母蒽醌提取率呈直线上升趋势；当料液比为1∶25 g/mL时，提取率达最高；但随着溶剂用量进一步增加提取率略显降低趋势。可能是由于一开始植物细胞膜内外浓度差比较大，有利于其溶出。但当料液比为1∶25 g/mL时植物细胞中该成分已经被较完全地提取出来，故再增加溶剂用量其提取量也无明显提高，而且还会使生产成本升高。故料液比为1∶25 g/mL时浙贝母蒽醌提取率最佳。

图4 料液比对浙贝母蒽醌提取率的影响

2.2 响应曲面优化实验结果与分析

以浙贝母蒽醌提取率(Y)为考察指标，在单因素实验基础上，对提取时间(A)、料液比(B)和乙醇浓度(C)这3个因素，按照响应面法的三因素三水平，设计17组实验，结果见表2。

表2 响应面分析实验设计及实验结果

根据表1 ，以浙贝母蒽醌提取率(Y)为响应值，用Design-Expert 8.0.6进行多元回归拟合分析，可得到提取条件与浙贝母蒽醌提取率(Y)之间的二次多元回归方程：

Y=0.16-3.250E-003A+3.500E-003B-3.000E-003C-7.750E-003AB+4.250E-003BC-7.425E-003A2-8.925E-003B2-0.018C2

(2)

式(2)中，Y代表浙贝母蒽醌的提取率，A代表提取时间，B代表料液比，C代表乙醇浓度。

该回归模型的方差分析结果见表3。由表3可知，该模型具有极显著性(P<0.001)，失拟项P=0.7459>0.05，不显著，说明该二次方程模型很显著，可以利用该模型确定最佳提取工艺条件。回归项AB、A2、B2、C2对浙贝母蒽醌提取率均达到了极显著水平。进一步说明了建立的回归方程有较好的拟合性，也证明了实验设计的可行性。同时由F值可以看出，对浙贝母蒽醌提取率的影响顺序依次为料液比(B)>提取时间(A)>乙醇浓度(C)。

表3 方差分析结果

应用minitab 软件，得到响应面分析图(图5～图7)。由图5可以看出提取时间和乙醇浓度的曲面都有一定坡度，表明了两者对浙贝母蒽醌的提取率均具有影响，其中乙醇浓度的影响程度较提取时间的影响程度要更大些。等高线图趋于椭圆形，但不明显，表明提取时间和乙醇浓度这两个因素的交互项对浙贝母蒽醌的提取率没有显著影响。可确定最佳参数范围为：提取时间20～25 min，乙醇浓度74%～76%。在此区间内浙贝母蒽醌的提取率最大。

图5 提取时间和乙醇浓度的响应面图和等高线图

由图6可以看出，料液比与乙醇浓度的曲面均有坡度，而且料液比的曲面坡度更陡，表示料液比的二次项对浙贝母蒽醌的提取率有明显的影响，而乙醇浓度对其的影响较前者略小。可以确定两因素最佳水平参数范围：料液比1∶20～1∶26 g/mL，乙醇浓度74%～76%。在此范围中浙贝母蒽醌的提取率最大。

图6 料液比和乙醇浓度的响应面图和等高线图

由图7可以看出，料液比与提取时间的曲面均有坡度，而且提取时间的曲面坡度更陡，表示提取时间的二次项对浙贝母蒽醌提取率有明显的影响，而料液比对其的影响较前者略小。可以确定两因素最佳水平参数范围：料液比1∶20～1∶26 g/mL，提取时间20～25 min。在此范围中浙贝母蒽醌的提取率最大。

图7 料液比和提取时间的响应面图和等高线图

根据响应曲面得出的最佳工艺是：料液比1∶22.47 g/mL、提取时间22.24 min、乙醇浓度74.08%。在此提取条件下，浙贝母蒽醌提取率的预测值为0.1635%。

2.3 工艺验证

为了验证响应面模拟得出的最佳工艺条件的可行性，对模拟得出的数据进行放大验证，结合实际的可操作性将提取工艺各参数调整为：料液比为1∶22 g/mL、提取时间22 min、乙醇浓度为74%。进行3批验证试验(表4)，测得平均总蒽醌提取率为0.1587%，与预测值0.1635%接近，表明模型拟合度良好，具有较好的可行性。故可应用于浙贝母蒽醌的提取。

表4 工艺验证结果

2.4 浙贝母蒽醌的抑菌活性实验结果

浙贝母蒽醌的抑菌活性实验结果见表5，从表5可以明显看出，该蒽醌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑制作用，随着浙贝母蒽醌浓度的增加，抑菌圈直径呈增大趋势。当浙贝母蒽醌溶液浓度为10 mg/mL时，对这两种菌的抑制效果最好；其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最显著，其抑菌圈直径为5.18±0.6 mm，大肠杆菌抑菌圈直径为3.06±0.3 mm。

表5 浙贝母蒽醌对不同菌种的抑菌圈直径 mm

3 结论

本研究采用响应面数学模型优化了超声-辅助提取浙贝母蒽醌的工艺，最终得到的最佳工艺条件为：料液比1∶22 g/mL、提取时间22 min、乙醇浓度74%，此时的实际提取率为0.1587%，与预测值0.1635%相差甚小，说明利用响应面法优化得到的模型准确、可靠、可行，可用于浙贝母蒽醌的提取工艺。同时通过牛津杯法抑菌试验发现，浙贝母蒽醌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且随着浙贝母蒽醌浓度的增加，抑菌圈直径呈增大趋势；当浙贝母蒽醌溶液浓度为10 mg/mL时，对这两种菌的抑制效果最好。这与含蒽醌植物的抗菌、抗炎、泻下、抗癌等药理活性及贝母的清热化痰、散结解毒的功效相吻合。通过本课题的研究，为浙贝母蒽醌抗菌机理的研究奠定了一定的实验基础，同时也为该药材在各领域的广泛应用提供了参考依据。