漯河垃圾填埋场除臭菌种筛选及培养条件优化

赵党阳

(漯河市环境卫生服务中心，河南 漯河 462000)

随着社会经济的快速发展，生活垃圾量增长迅速，卫生填埋仍然是现阶段垃圾的主要处理方式，填埋过程中会产生大量的恶臭气体，主要组分包括含氮化合物、硫化物、烃类及芳香烃、卤代烃以及酮醇醛酚等含氧有机物，严重影响人体健康[1]。经过近年来的研究，生物除臭法越来越受到重视，与物理、化学等除臭方法相比，具有处理效率高、工艺流程简单、适用范围广及处理费用低等优点。除臭微生物种类繁多，如何筛选出适应本地环境的高效菌株成为生物除臭法效果的关键。

本研究从漯河市垃圾卫生填埋场的生活垃圾和垃圾渗滤液中分离筛选有效除臭菌株，通过实验优化菌种培养条件，并对除臭效果进行检验研究，目的在于减轻垃圾填埋场产生的恶臭气体对环境的污染。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验材料来源

试验用材料取自漯河市垃圾卫生填埋场新进场垃圾和新鲜产生的垃圾渗滤液。

1.1.2分离菌种所用培养基[2]

营养琼脂培养基：蛋白胨(5 g)、牛肉膏粉(5 g)、琼脂(19 g)、氯化钠(5 g)、蒸馏水(1 000 mL)，pH值(7.0～7.2)，121 ℃灭菌30 min。营养肉汤培养基：蛋白胨(10 g)、牛肉膏粉(3 g)、氯化钠(5 g)、蒸馏水(1 000 mL)，pH值(7.0～7.2)，121 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1菌种分离纯化

将生活垃圾粉碎后与垃圾渗滤液用无菌水稀释，手动振荡10 min，充分摇匀，采用十倍稀释法制成10-9～10-3的菌悬液，采取平板表面涂布法将不同浓度的溶液分别涂布于营养琼脂培养基上，每个浓度重复3次，在30 ℃恒温培养箱培养24 h。将培养基上的菌落采用平板稀释分离法进一步纯化，获取纯培养，然后将特征不同的菌落在营养琼脂培养基斜面培养，保存备用[3]。

1.2.2菌种筛选

将分离出的菌株分别接种到营养肉汤培养基中，置于200 r/min摇床上，在30 ℃恒温条件下培养5天，将培养物按10%接种量分别接种到装有100 g破碎后的生活垃圾、垃圾渗滤液的1 L锥形瓶中，用玻璃棒搅匀后密封，30 ℃静止培养7天，期间均匀间隔24 h，用恶臭气体浓度测定仪测定恶臭气体浓度，选取指标为氨气和硫化氢，以此来判定菌株的除臭效果。

1.2.3组合菌除臭剂的制备

将互不拮抗的菌株进行两两组合、三三组合、全部组合，共有11个处理组，然后选出抑制氨氮和硫化氢效果最好的菌种组合[4]。经斜面活化后接种到装有营养肉汤培养基的三角瓶中，置于200 r/min摇床上，在30 ℃恒温条件下培养5天，即获得组合菌除臭剂。

1.3 组合菌剂除臭条件优化

分别在温度为20、25、30、35、40 ℃，培养时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90 h培养基pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和接种量5%、10%、15%、20%、25%条件下，测定组合菌除臭剂对氨气和硫化氢的去除率，每个试验重复3次[5]。

1.4 菌株的鉴定

经过菌株筛选试验，对具有明显抑制氨气和硫化氢的菌株进行观察和生理生化性能测定，参考《伯杰细菌鉴定手册》鉴定除臭微生物的种属[6]。

2 结果与分析

2.1 菌种分离纯化

通过划线法分离菌株，根据菌株的颜色、边缘透明度、形状和镜下观察结果，样本中的微生物分类结果见表1。

表1 样本中微生物分类

由表1得知，新鲜进场垃圾和新鲜垃圾渗滤液中共分离出细菌、真菌和放线菌37株，其中细菌数量最多，其次是真菌，放线菌数量最少，所占比例分别为59.5%、24.3%、16.2%。另外，从表1可以看出，新鲜生活垃圾中微生物数量比新鲜垃圾渗滤液中微生物数量多，所占比例分别为62.2%、37.8%。

2.2 菌株的筛选

将分离得到的37株菌种分别接种到培养基中，在30 ℃恒温、200 r/min摇床条件下培养5天，然后按10%接种量分别接种到装有100 g新鲜粉碎生活垃圾的1 000 mL锥形瓶中，并用玻璃棒将培养液和垃圾搅拌均匀，密封锥形瓶，30 ℃恒温条件下培养7天。期间每隔24 h分别测定氨气和硫化氢浓度，与对照比较，除臭效果明显的有6株，分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L6。

测定结果如表2所示。

表2 不同菌株在不同时间内去除NH3和H2S的效率

续表2 不同菌株在不同时间内去除NH3和H2S的效率

从表2可以看出，去除NH3和H2S效果明显的菌株有6种，其中有4种为细菌，1种为真菌，1种为放线菌。对NH3去除率最高的是L1，去除率达到40.7%，对H2S去除率最高的是L1和L3，去除率均为54.5%。这表明，细菌的除臭效果较好。从时间上来看，对于NH3和H2S的去除率较高的时间段集中在2～4天，从5天起效果不再增加，尤其是H2S去除方面基本保持不变，这可能是因为培养基营养消耗殆尽，菌落生长逐渐停滞的缘故[7]。

2.3 组合菌种除臭剂的制备

2.3.1菌株之间的拮抗性试验

将筛选出的6种菌株在琼脂培养基上“两两”十字划线，若菌株之间有拮抗作用，则交叉处无菌落生长，用“+”表示，反之用“-”表示，结果见表3。

表3 除臭菌株之间的拮抗性

从表3可以看出，L1、L2、L3三种细菌菌株之间无拮抗性，L1和L6、L4和L5、L4和L6之间分别存在拮抗性。由于L1对NH3和H2S的去除率较高，而L4与L1、L2、L3菌株之间均无拮抗作用，因此选择L1、L2、L3、L4这四种菌株制备组合菌除臭剂。

2.3.2最佳组合菌种除臭剂的制备

将四种菌株分别按照“两两”“三三”和全部组合，测定其对NH3和H2S的去除率，见图1、图2。

图1 不同组合菌种对NH3去除效果的影响

图2 不同组合菌种对NH3去除效果的影响

从图1和图2可以看出，不同菌种之间的组合，对于NH3和H2S的去除率，有的比单株高，有的比单株低，虽然通过拮抗性试验，各菌种之间互不拮抗，但可能存在某种互相抑制作用影响NH3和H2S的去除率。从图1和图2还可以看出，L1+L2+L3+L4组对NH3去除率达47.3%，对H2S的去除率达57.7%，去除效果最佳，所以用4种菌株全组合制备除臭剂。

2.4 组合菌株除臭剂优化条件确定

2.4.1不同温度对除臭剂效果的影响

将除臭剂接种在新鲜垃圾锥形瓶中，分别在20、25、30、35、40 ℃条件下，测定对NH3和H2S的去除率，结果见图3。

图3 不同温度对除臭剂效果的影响

由图3可以看出，随着温度的增加，菌株对NH3和H2S两种气体的去除率均呈现先升高、后降低的趋势。当温度为30 ℃时，菌株对两种气体的去除率最佳。其原因可能是温度对微生物酶活性的影响，从而对除臭效果有所影响。

2.4.2不同发酵时间对除臭剂效果的影响

在最佳除臭温度30 ℃条件下，将除臭剂接种在盛有新鲜垃圾的锥形瓶中，分别测定10、20、30、40、50、60、70、80、90 h不同发酵时间对除臭效果的影响，结果见图4。

图4 不同时间对除臭剂效果的影响

由图4可以看出，随着发酵时间的增加，菌株对NH3和H2S两种气体的去除率均呈现先升高、后降低的趋势。当发酵时间为60 h时，菌株对两种气体的去除率最佳。发酵时间过短，微生物生长数量不足，除臭相关的酶分解较少；发酵时间过长，营养物质消耗殆尽，菌株逐渐死亡，再加上代谢废物浓度增多，对菌株的生长抑制作用逐渐增强，同样会影响除臭效果[8]。

2.4.3不同pH值对除臭剂效果的影响

按照最佳除臭温度30 ℃和发酵时间60 h，调节新鲜垃圾pH值，测定pH值对除臭效果的影响。结果见图5。

图5 初始pH值对除臭剂效果的影响

由图5可以看出，初始pH值在5～8.5时，随着pH值升高，菌株对NH3和H2S两种气体的去除率均呈现先升高、后降低的趋势。当初始pH值为6.5时，菌株对两种气体的去除率最佳。pH值对微生物代谢活动影响较大，不同pH值会直接影响除臭菌株的酶分解效果[9]。

2.4.4不同接种量对NH3和H2S的抑制影响

按照最佳除臭温度30 ℃、发酵时间60 h和pH值6.5的条件下，将除臭剂最优组合菌株按照不同的接种量接种于新鲜垃圾中，结果见图6。随着接种量的提高，菌株对NH3和H2S两种气体的去除率均呈现先升高、后降低的趋势。当接种量为15%时，菌株对两种气体的去除率最佳。接种量对微生物对数生长期影响较大，可以缩短发酵阶段菌体生长的延滞期，从而缩短发酵周期，但并不是接种量越大越有利，当接种量从15%递增到25%时，除臭效果下降，这可能是因为接种量过高导致菌种提前进入衰亡期[10]。

图6 不同pH值对除臭剂效果的影响

2.5 菌株的初步鉴定

将4种菌株分别接种在琼脂营养培养基平板上，在30 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察菌落特征，随后进行生理生化性能测定，结果见表4。

表4 四种菌株的个体形态及生理生化特征

3 结论

自然界中，臭气产生源必然存在抑制臭气的微生物，通过分离筛选出这类微生物，优化培养形成优势混合菌群，通过多种微生物之间互营共生作用、菌株间的加性效应，能够更好地对恶臭产生抑制作用。从漯河市垃圾卫生填埋场新鲜生活垃圾和新产生的渗滤液中分离出的37种菌株中有6株对NH3和H2S抑制效果明显，通过拮抗试验，确定了4种菌株用来制备组合菌株除臭剂。对复合微生物除臭条件优化结果表明：最佳除臭温度为30 ℃、发酵时间为60 h、pH值为6.5、接种量为15%。在最佳除臭条件下，NH3的去除率为58.7%，H2S的去除率为72.2%。通过菌株的初步鉴定，L1、L4为乳酸片球菌，L2为巨大芽胞杆菌，L3为粪产碱杆菌[11]。