笃斯越橘继代增殖中激素、碳源的调节研究

叶纯子，董希文，吴炳懿

(哈尔滨市林业科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150028)

笃斯越橘(Vacciniumuliginosum)又称笃斯、都柿、野生蓝莓，为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)落叶灌木。笃斯越橘资源丰富，具有较高的野生观赏价值[1]，我国黑龙江、吉林、内蒙古、辽宁等地均有分布[2]，喜光，喜湿，耐低温[3]，主要生长在针阔叶混交林或针叶林下沼泽草甸或疏林处[4]，海拔300～900 m的泥炭鲜沼泽草甸中也有分布。笃斯越橘果实营养丰富，果中含有丰富的维生素、糖类、氨基酸，微量元素等营养成分[5,6]。目前关于蓝莓研究较多，在实验室的组织培养[7]、无性扦插、苗木栽培的相关研究已经积累了丰富的经验，且具有较大的参考价值。但国内针对笃斯越橘在多激素组合及碳源应用上的研究并不太多。该试验从激素和碳源上探究这些因素对笃斯越橘继代增殖的调节作用，从而找适宜的培养基用于开展笃斯越橘继代试管苗的快速繁殖，以期获得合理有效且节本的生产组合方案，为进一步提高工厂化育苗生产效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料为野生蓝莓组培苗，来源于哈尔滨市林业科学研究院组织培养室。

1.2 试验方法

1.2.1 不同激素对笃斯越橘继代生长的影响 选取健壮的试管苗，在无菌操作台上剪取生长状况相同的苗芽茎段接种到继代增殖培养基中。以改良WPM为基本培养基〔以Ca(NO3)2·4H2O、KNO3代替原WPM培养基中的K2SO4、CaCl2，Fe盐加倍〕，将试管苗茎段分别转接于改良的WPM培养基，附加蔗糖25 g·L-1、琼脂7 g·L-1，分别添加不同浓度的ZT(0.5、1.0、1.5)、KT(0、0.5、1.0)和IBA(0、0.3、0.5)组合，对ZT浓度、KT浓度、IBA浓度进行3因子3水平的L9 (33)正交试验。培养45 d后，观察苗生长状况，测定丛生芽增殖个数、高度，研究不同浓度的ZT、KT、IBA对笃斯越橘试管苗继代增殖的影响，筛选最优组合。每处理接种5个芽，接种10瓶，重复3次。

1.2.2 不同碳源对笃斯越橘继代生长的影响 选取长势相同、健壮的笃斯越橘试管苗接种到改良WPM培养基中，培养基碳源分别为不同浓度的蔗糖(20、30和40 g·L-1)和白糖(20、30和40 g·L-1)，培养45 d。每处理接种5个芽，接种10瓶，重复3次。观察试管苗的生长情况，筛选出适宜的碳源及其浓度。

1.2.3 培养条件 培养基高压灭菌前的pH值均为5.3～5.5，在121 ℃下高压灭菌20 min。培养温度为25 ℃±2 ℃，光周期为14 h·d-1，光照度为2 000～2 500 lx。

1.2.4 统计方法 接种第45天观察丛生芽生长状况，计算芽平均个数、平均高度，统计增殖系数。

增殖系数=(萌出的茎段数/组培苗的株数)×100%

数据用Excel、SPSS19.0等软件进行方差分析和Dancan多重比较。

2 结果与分析

2.1不同激素类型和浓度对笃斯越橘继代生长的影响

表1 不同激素类型和浓度对笃斯越橘继代生长的影响

由表1可知，不同处理之间的笃斯越橘丛生芽萌发数量、芽高、增殖系数及生长状况等相差较大。从实际试验结果来看，处理2即改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+ IBA 0.3 mg·L-1的培养基的增殖效果好，其丛生芽个数6.5个，平均高度为5.92 cm，增殖倍数达到了18.4，诱导出的芽苗长势好，生长旺盛，芽茎粗，叶片颜色较深，为浓绿色(图1)。其次为处理6组，未添加激动素，增殖倍数为15.8，芽苗长势好，芽茎粗，叶浓绿色。在试验中发现，在不添加其他激素的情况下，当ZT浓度降低到0.5 mg·L-1水平单独作用于培养基时，此培养基中笃斯越橘试管苗增殖倍数显著下降，仅为6.5(图2)。究其原因，处理1组中分裂素水平较低，虽然芽生长速度较快，平均高度达6.51 cm，是所有处理组中最高的，但其分化的愈伤组织较小，丛生芽数量较少，仅为2.3，远低于其他组，导致整体增殖效率较低。

2.2培养基中不同碳源对笃斯越橘继代生长的影响

糖分是植株生长的主要营养来源，是培养基中碳源来源的主要途径。通过在培养基中添加不同浓度的蔗糖、白糖两种碳源进行试验，研究结果(表2)表明，在改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+琼脂7 g·L-1的培养基中，蔗糖、白糖分别作为碳源在相同浓度水平下，在笃斯越橘继代增殖效率上，两者差异不显著；但浓度不同时影响较大，且差异性显著。其中，采用蔗糖浓度为30 g·L-1的处理增殖效果较好，芽增殖系数最高，为19.6；其次是白糖浓度为30 g·L-1的处理，增殖系数为19.2。这两个处理间对笃斯越橘不定芽继代增殖培养的增殖系数影响差异不显著，且在植株生长状态上2组处理的植株生长正常，均有较多新芽长出，在苗长势上两者间无明显差异。因此，从经济效益的角度出发，在笃斯越橘组培生产中为了降低生产成本，可以选用白糖替代蔗糖。

从表2还可以看出，不论是白糖还是蔗糖，在平均苗数、平均苗高及增殖系数上，处理20 g·L-1浓度、处理30 g·L-1浓度与处理40 g·L-1浓度间差异达到显著水平。在生长状况上，以处理30 g·L-1浓度最好，芽苗健壮，茎较粗，叶片呈浓绿色，优于其他的浓度水平。

3 结论与讨论

3.1 在植物组织培养中，除了基本培养基外，激素种类和浓度是影响继代增殖的重要因素。此外，细胞生长素和细胞分裂素浓度配比也很重要，过高的生长素可能会抑制试管苗茎的伸长导致幼苗矮化。从实验结果来看，在笃斯越橘试管苗继代增殖阶段，细胞分裂素ZT、KT及细胞生长素IBA对芽的诱导和增殖作用至关重要。分裂素ZT适用于不定芽诱导，诱导时间短，两周左右就可以诱导出笃斯越橘不定芽；KT与IBA协同作用对丛生芽的生长有良好的促进作用。通过本研究分析可知，在蔗糖 25 g·L-1+琼脂 7.0 g·L-1条件下，改良WPM附加ZT 0.5 mg·L-1、KT 0.5 mg·L-1、IBA 0.3 mg·L-1的培养基能较好地诱导笃斯越橘丛生芽萌发增殖，45 d时增殖系数为18.4。

3.2 糖在组织培养中的效应已越来越引起人们的重视，作为碳源，糖既可为植物细胞的呼吸代谢提供能量，还可维持培养环境的渗透势。糖在培养基里的种类和用量对培养物生长速度和生长量有一定的影响。在比较不同碳源对笃斯越橘试管苗生长的影响中，试验结果表明，使用改良WPM +ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7.0 g·L-1培养基对笃斯越橘芽的增殖效果最好，用相同浓度的白糖替换蔗糖后，笃斯越橘试管苗增殖倍数略有降低，但差别不大；而且从生长情况来看，以白糖为碳源的丛生芽长势与以蔗糖为碳源的丛生芽长势相似，苗茎粗细、高度及叶片颜色均无明显差别。因此，本研究认为大规模工业化生产笃斯越橘组培苗时，在尽量保证苗质量的前提下，为了降低生产成本，可以选择白糖作为碳源。