“青蛙骨髓细胞染色体标本的制备”实验的改进*

韩 伟 邹佩贞 石海英 田志环

（韶关学院英东生物与农业学院 广东韶关 512005）

根据实验教学经验，对科学出版社《细胞生物学实验教程（第2 版）》教材中的“青蛙骨髓细胞染色体标本的制备”［1］实验提出几点改进。

1 实验材料的选择

选择饲养的青蛙做实验材料。饲养的青蛙一年四季都可购置。青蛙虽然携带的寄生虫比较多，但是相对安全，一般不携带人畜生共患病的病原菌，且实验前不需要提前很长时间购买，现做现买，实验材料准备容易方便。为了实验能收集到更多的骨髓细胞，建议购买较大的青蛙，一般体重在150～350 g 左右，足够的体重，才能获得足够的细胞［2］。每2 名学生用一只青蛙，每名学生取青蛙的1 条后腿收集骨髓细胞。

2 秋水仙素的处理

2.1 处理时间 教材上表述实验前3～4 h 向动物的腹腔注射秋水仙素，这个处理时间不是绝对的。笔者发现冬天温度较低时（例如约10℃时），提前3～4 h，用秋水仙素处理青蛙，若时间较短，实验结果观察到大部分骨髓细胞分裂处于前期阶段，中期分裂相较少（图1A）。考虑青蛙冬季冬眠的原因，活动量少，应提前较多时间用秋水仙素处理，通过实验发现在室温较低时（低于10℃），可提前10 h 用秋水仙素注射处理，特别是冬季早上做实验时，更应该在前一天晚上向青蛙腹腔注射秋水仙素，否则准备不方便。当室温在25℃左右时可提前3～4 h 用秋水仙素处理，但也要合理安排上实验课的时间。

图1 青蛙骨髓细胞染色体标本的制备图（10×40）

2.2 用量 秋水仙素的用量，一般根据青蛙的体重确定。教材按动物每克体重2～4 μg 的剂量进行注射。实际按每克青蛙10 μg 进行注射也得到了良好的效果（图1B 和图1C），这与文献［2］和教材［3］提及的秋水仙素处理的用量一致。

3 注射生理盐水

用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的

注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。采用盛有0.65% NaCl的注射器插入股骨的上端冲出骨髓细胞。

4 低渗处理

教材上低渗处理：弃上清液，加入6 mL 蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置于37℃温箱中低渗20 min［1］。实验时改为弃上清液，加入6 mL 0.4% KCl，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置于37℃水浴锅中低渗30 min。发现用0.4% KCl低渗对于不熟练操作的人来说比蒸馏水效果好。这与方玲等［4］和赵刚等［5］采用的低渗液一致。

5 固定液的配制

固定液现配现用，因为冰醋酸容易挥发。采用预固定和第1 次固定时配一次，第2 次固定时再配一次。这样固定液中的冰醋酸挥发相对较少，固定效果好。

6 染色液的配制

Giemsa 染液现配现用。于染色前30 min 将Giemsa 原液用10 倍体积的1／15 mol／L 磷酸缓冲液（pH=7.4）稀释，配制。

7 滴片

采用湿的冰冻切片，向载玻片上滴加悬浮的骨髓细胞要有一定的高度。高度太低时细胞松散不开，高度太高则细胞容易滴到载玻片外面，一般离载玻片至少40 cm 进行滴片，滴片后用嘴向一个方向吹气，使细胞和染色体充分分散。

8 加热干燥

滴片置酒精灯上方来回微微加热干燥。不能在一个位置加热干燥，不能过分干燥。

9 显微镜观察

滴片在显微镜下观察，采用逐行观察、平扫的方式，这样才容易找到分散均匀的染色体。先在低倍镜下观察，再换高倍镜进行观察。如果能结合数码显微镜互动实验室进行观察，学生可拍摄并保存照片，与实验教师进行互动，实验效果会更好。拍到的照片可用来核型分析（图1D）。参考周洲等［6］的方法，利用Photoshop 软件对图1D 进行染色体核型分析，得到图2核型分析图。

图2 青蛙骨髓细胞染色体核型分析图

总之，任何实验都不能照搬实验指导教材，指导教材上的方法只是针对大多数情况下使用的，做实验时要根据实际条件和环境，实时调整，制定合适的实验步骤，才能得出好的实验结果。