一种大白菜新型甘蓝型油菜CMS快速鉴定方法及应用

刘晓东，李海山，孟 川，王玉海，吴 芳，牟金贵，马俊贤,王明秋

(1.河北省农林科学院 经济作物研究所，河北省蔬菜工程技术中心，河北 石家庄 050051；2.河北省农林科学院， 河北 石家庄 050031;3.河北省市场监督管理局,河北 石家庄 050091)

大白菜(Brassicarapapekinensis)是我国北方重要的蔬菜作物，育种方式仍以杂交育种为主，重点在于杂交亲本的选育。经历了自交系育种、自交不亲和系育种、雄性不育系育种3个阶段，通过回交转育、抗病聚合、品质筛选等多种技术手段，实现了新资源、新品种的创新选育。利用植物雄性不育系进行杂交种的选育，已成为当前育种的主要手段之一。自20世纪70年代中国学者开展大白菜雄性不育系的选育与利用以来，先后有谭其猛[1]、张书芳[2]、冯辉[3]、柯桂兰[4]、孙日飞[5]、张德双[6]等分别育成了核隐性雄性不育系、核基因互作型雄性不育系、复等位基因型雄性不育系、甘蓝型油菜PolCMS、新型萝卜胞质CMS、新型甘蓝型油菜CMS等材料，并育成了相关的品种。

然而在雄性不育系选育与利用过程中仍然存在一些问题，如利用核隐性雄性不育系制种，不育系存在50%的可育株，不但杂交种纯度难以保障，拔除可育株[7-8]费工费力而且降低单位面积产量；采用100%核基因雄性不育系，因采用三系配套，杂交制种实际上为三交种，若甲型“两用系”与“保持系”遗传基础差距较大时，易出现F1不整齐现象[9]；采用PolCMS不育系配制杂交种，因PolCMS具有对环境敏感的特性，在温度变化时极易恢复育性，造成杂交纯度降低的问题[10]。而新型甘蓝型油菜CMS具有不育性稳定、蜜腺正常、配合力好的特点，可以作为大白菜细胞质不育系材料创制的不育源。

目前，采用分子标记的方法对不同细胞质不育类型进行鉴定，主要利用与目标性状紧密连锁的遗传标记，进行分子鉴定，存在需要从萝卜OguCMS特异性核苷酸序列orf138[11]，甘蓝型油菜PolCMS特异性核苷酸序列orf222[12]、orf224[13]中选取多对标记引物才能从大白菜细胞质雄性不育系中鉴定出新型甘蓝型油菜CMS的问题，本研究通过设计开发了一对引物即可快速鉴定新型甘蓝型油菜CMS的分子标记，以不同时期回交转育获得的不同类型雄性不育系材料为试材，以现有的引物进行分子标记鉴定为对照，建立了一种快速鉴定新型甘蓝型油菜CMS的方法，并对回交转育了该基因的雄性不育系材料进行了鉴定。

1 材料和方法

本试验于2014年8月11日对CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高进行播种，苗期选取细胞分生能力最强的大小约2 cm2柔嫩心叶，每株1～2 g，进行DNA提取。依据orf138、orf222、orf2243个基因序列，通过现有技术引物扩增分子标记进行不育类型分析鉴定，筛选出新型甘蓝型油菜CMS不育材料。以设计的新引物分子标记鉴定转育四倍体不育系CMS-D571、CMS-D574和相应保持系D571、D574。

通过对比orf138、orf222、orf2243个线粒体特异核苷酸序列，采用引入错配碱基的方法[14]，设计专用型引物，并对利用新型甘蓝型油菜CMS转育的四倍体雄性不育系进行鉴定。

试验采用CTAB基因提取法[15]提取待测样品的基因组DNA，以待测细胞质雄性不育系大白菜样品的基因组DNA为模板，以不同引物进行PCR扩增。PCR的反应体系为：总体积20 μL，Buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，正反引物(10×)各0.5 μL，gDNA(2.5～5.0 ng/μL)模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O补齐至20 μL。

PCR反应试剂Buffer、TaqDNA聚合酶为北京全式金公司Trans Gen Biotech的PCR反应试剂盒；反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 min[16-18]。

核苷酸序列通过在线序列比对软件MulAlin对其进行比对。

扩增产物凝胶电泳检测：将PCR产物用加有EB(溴化乙啶)的1%琼脂糖在100～120 V的电压下电泳30～40 min，最终在凝胶成像系统上显示。

2 结果与分析

2.1 大白菜新型甘蓝型油菜CMS不育材料的筛选

对3种不育类型的CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高鉴定采用现有的技术引物开展RAPD分子标记，依据3种不育类型基因特异片段orf138、orf222、orf224的差异性设计出引物，利用orf138、orf222、orf224扩增的引物核苷酸序列如表1所示。

经PCR扩增电泳凝胶成像显示，由图1可知泳道1-3为CMS后36高3次重复，利用orf138和orf222的2种引物扩增后，分别扩增出300，700 bp的DNA片段，表明CMS后36高为新型甘蓝型油菜CMS类型；泳道4-6为CMS-AQ293次重复，利用orf138的引物未扩增出DNA片段，而利用orf222的引物扩增出了700 bp的DNA序列，且利用orf224的引物扩增出了650 bp的DNA片段，准确表明CMS-AQ29为PolCMS类型；泳道7，8为CMS-AM41的保持系M41的2次重复，3种引物均未扩增出DNA片段，表明M41为自交系，与实际吻合；泳道9，10为CMS-AM41的2次重复，利用orf138的引物扩增出了300 bp的DNA片段，而利用orf222的引物并未扩增出DNA序列，表明CMS-AM41为OguCMS类型。CMS后36高为筛选的特定雄性不育源。

表1 利用orf138、orf222、orf224基因片段扩增引物Tab.1 Primer amplification according to orf138, orf222, orf224

M.Marker;1-3.CMS后36高；4-6.CMS-AQ29；7,8.M41；9,10.CMS-AM41。 M.Marker; 1-3.CMS hou36gao; 4-6.CMS-AQ29; 7,8.M41; 9,10.CMS-AM41.

2.2 Pol CMS与新型甘蓝型油菜CMS经PCR扩增产物核苷酸序列差异分析

依据现有技术中orf222引物在PolCMS与新型甘蓝型油菜CMS的大白菜DNA中均能扩增出700 bp左右的片段，经测序对比2种类型雄性不育系PCR扩增产物的核苷酸序列，筛选差异序列。

以提取的分别含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29基因组DNA和含有新型甘蓝型油菜CMS不育基因的CMS后36高基因组DNA为模板，通过引物orf222进行PCR扩增， 经在线序列对比软件MulAlin对其进行比对，如图2所示，2组序列同源性高达84.44%，差异性较明显的序列片段位于180～210 bp。

图2 CMS后36高与CMS-AQ29扩增核苷酸序列差异性对比Fig.2 Comparison of CMS hou36gao and CMS-AQ29 amplified nucleotide sequences

2.3 新型甘蓝型油菜CMS专用引物O-2的设计

依据扩增产物核苷酸序列orf222-Pol和orf222-New CMS(图2)设计引物。在其上游引物 Fw:5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGTA-3′的3′端引入T/G错配碱基，引入后序列变更为Fw:5′-AAGCTTGGT GGAAAAGATCGGA-3′，碱基错配降低了引物与其3′末端互补模板之间的延伸。从而使得新设计的引物不能以甘蓝型油菜PolCMS的大白菜DNA为模板进行扩增，因此,成为鉴定新型甘蓝型油菜CMS大白菜的特异引物。该引物定名为“O-2”，其核苷酸序列为：

Fw: 5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGGA-3′，Rv: 5′-GATTTCGTTCACCTTGGCTCT-3′。

以提取的CMS后36高基因组DNA为模板，通过引物O-2进行PCR扩增，大小为474 bp,核苷酸测序如图3所示。

2.4 不同引物分子标记鉴定新型甘蓝型油菜雄性不育系及其保持系

以转育了新型甘蓝型油菜CMS的四倍体大白菜材料 CMS-D571、CMS-D574和相应的保持系D571、D574为试材，通过现有技术引物进行分子标记，如图4所示，经orf138、orf222鉴定，CMS-D571>(泳道1-3)、CMS-D574(泳道9，10)分别在300，700 bp处形成亮带，而orf224相应位置无亮带，表明CMS-D571、CMS-D574成功转育为了新型甘蓝型油菜CMS，而保持系D571(泳道4-6)、D574(泳道7，8)试验中未检出相关基因。

图3 利用新型引物 O-2 扩增出的核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequences amplified using novel primer O-2

M.Marker;1-3.CMS-D571；4-6.D571；7,8.D574；9,10.CMS-D574；11.ddH2O。图5同。 M.Marker; 1-3.CMS-D571; 4-6.D571; 7,8.D574; 9,10.CMS-D574; 11.ddH2O.The same as Fig.5.

分别以CMS-D571、D571、D574、CMS-D574的DNA为模板，通过设计的新型引物O-2进行核苷酸序列扩增，经凝胶电泳检测，结果如图5所示。CMS-D571和CMS-D574均在470 bp处扩增出了产物，证实为成功转育了新型甘蓝型油菜CMS的雄性不育系材料，而保持系D571和D574则未扩增出产物，为自交系材料。

图5 采用O-2引物对CMS-D571、D571、D574、 CMS-D574雄性不育分子标记鉴定Fig.5 Molecular marker identification of male sterility lines CMS-D571, D571, D574, CMS-D574 by O-2 primer

3 讨论

张德双[19]、王国芳等[20]对3种不育类型的鉴定采用RAPD分子标记法，找出3种不育类型基因的特异片段进行测序，根据核苷酸系列的差异性设计引物，并转换为SCAR标记：orf138、orf222、orf224。但orf138在OguCMS与新型甘蓝型油菜CMS的DNA序列中均能扩增出300 bp大小的片段。orf222在PolCMS与新型甘蓝型油菜CMS的DNA序列中同样能扩增出700 bp大小的片段，orf224只能在PolCMS的DNA序列中能扩增出650 bp大小片段。

本研究通过采用现有技术引物，从已掌握的二倍体大白菜细胞质雄性不育系中筛选出了含有新型甘蓝型油菜CMS的不育系材料CMS后36高和含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29，通过核苷酸测序对比，筛选出了位于180～210 bp差异性较明显的序列片段。通过碱基错配，设计开发了一对引物O-2，对转育了新型甘蓝型油菜CMS的大白菜材料进行PCR核苷酸扩增，经电泳凝胶成像可在470 bp处形成亮带，而新引物不能以PolCMS的大白菜DNA为模板进行扩增，成为鉴定新型甘蓝型油菜CMS大白菜的特异引物。

利用该引物建立的快速鉴定新型甘蓝型油菜CMS的方法，扩增出的条带清晰，该分子标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，从DNA水平上鉴定了细胞质雄性不育系的大白菜品种，提高了准确性。相对于现有技术中需要多对引物才能鉴定大白菜是否为新型甘蓝型油菜CMS的问题，大大减少了鉴定工作量，提高了检测效率，对于促进利用大白菜雄性不育系育种进程具有重要意义。