环状RNA最新研究进展

李铁军，于勇，张孝卫，杜雪，史世娟，黄华

作者单位：250013 山东，济南市卫生科技交流服务中心

环状 RNA（circRNA）是一大类共价闭合环状 RNA，作为竞争性内源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）中的一员，参与 circRNA-miRNA-mRNA 网络调控，在生命活动和有关疾病的调控中发挥着重要作用。circRNA 通过外显子、内含子或两者的反剪接而产生，形成外显子或内含子 circRNA。研究表明circRNA 是普遍存在的分子，超过了人类细胞中分布的相关线性 mRNA；circRNA 由于具有共价闭环结构，对 RNase R 具有抗性，比线性 mRNA 具有更稳定的特性；circRNA 在不同物种中高度保守；circRNA 常表现为组织/发育阶段特异性表达[1]。有关 circRNA 的生物发生模式、机制、分类、生物学特点等已有众多综述予以总结归纳，在此不再详述。

近两年，circRNA 的生物学作用方面的研究增长迅速，其中关于 miRNA 海绵作用、翻译作用的研究占了大多数。海绵作用是 circRNA 的主要作用之一，此外，最近新发现融合环状 RNA（f-circRNA）在肿瘤的发生发展中起到了重要作用，引发人们关注。本文对此进行了归纳整理。

1 circRNA 的 miRNA 海绵作用

一般认为，circRNA 的重要功能之一是通过其结合位点负调控相应的 miRNA，从而影响其下游靶点分子，即所谓海绵作用。其中最具代表性的是人类 circRNA 小脑退化相关蛋白 1 转录本 (CDR1as)/ciRS-7，作为 miR-7 海绵，包含 70 多个 miR-7 结合位点，与 miR-7 结合并调控其功能，该研究首次证明 circRNA 具有 miRNA 海绵的功能。但直到 2017年，也仅有数种 circRNA 的海绵作用得到验证。随着转录组测序技术（RNA-seq）的发展，大量 circRNA 被发现，circbank 已收录超过 14 万种 circRNA，为 circRNA 的研究提供了有力支持。circRNA 海绵作用的研究方法成熟易行，近两年来，有关 circRNA 海绵作用的研究急剧增长，主要集中在癌症方面，为癌症治疗提供了一种新的治疗思路，并使得 circRNA 成为有希望的潜在生物标志物。从目前的研究看，circRNA 在癌症中的海绵作用大致可分为抑癌和促癌两大类。近期 circRNA 海绵作用的研究如表 1 所示（circRNA 名称从原文）。

表1 circRNA 海绵作用一览表

续表 1

表中统计了 62 种 circRNA 海绵，起促癌作用的 41 种，抑癌作用的 14 种，抑制 HCV 增殖 1 种，其他作用 6 种。涉及白血病、肝癌、胃癌、骨肉瘤、胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、肺腺癌、口腔癌、喉鳞癌、宫颈癌、胰腺导管腺癌、非小细胞肺癌等 15 种癌症。同种肿瘤可以与数种 circRNA 相关。

其中抑癌作用的 14 种 circRNA，除 3 种人工合成的外，其余 11 种均在相应细胞系或组织中表达下调。通过上调这些 circRNA，可以有效抑制癌细胞的生长、迁移和侵袭。而 41 种促癌 circRNA，与非癌组织相比表达上调，其过表达与临床严重程度密切相关，促进癌细胞的迁移和 侵袭。

一般认为 circRNA 海绵与对应的 miRNA 呈负相关，并由此上调下游靶点来发挥作用。但也有研究认为 circRNA 海绵可以与对应的 miRNA 呈正相关。Li 等[30]在骨肉瘤的研究中发现，Circ_ORC2 具有miR-19a 的结合位点，其表达与 miR-19a 表达呈正相关。circ_ORC2 与 miR-19a 结合，增强了 miR-19a 的表达，从而抑制下游 PTEN 的表达，激活 Akt 通路，促进骨肉瘤细胞的生长和侵袭。这些发现丰富了circRNA 的分子调控机制。Du 等[16]的研究也认为 Circ_ANKIB1 促进 miR-19b 的表达，抑制下游靶基因SOCS3 的表达，进而激活 STAT3 通路，circRNAs 稳定了 miRNA 的功能，对这一新功能的进一步研究将为肿瘤等疾病的诊断和治疗提供有意义的参考。

具有海绵作用的 circRNA 一般来自生物体自身，但也不排除来自外界的感染入侵。Qiao 等[15]首次报道 EB 病毒（EBV）编码的环状 RNA 可以通过海绵化 miRNAs 促进其靶基因的上调表达，涉及与 EBV 相关的恶性肿瘤。EBV 环状 RNA 共海绵化了 56 个 miRNA。其中 5 个 miRNA 与其靶标之间的网络包括 1414 个基因、1419 个节点和 2423 条边。这些靶点在多种类型中富集，大多数在 EBV 感染细胞中被上调。

值得注意的是，含有 miRNA 结合位点的 circRNA，是否一定是通过抑制对应的 miRNA 而发挥作用呢？Garikipati 等[62]研究认为，circFndc3b 在心肌梗死后心脏中的过度表达，增加了血管内皮生长因子（VEGF）的表达，通过 FUS/VEGF-A 轴调节心肌梗死后的心脏修复，增强新生血管，改善左心室功能，是促进心肌梗死后心功能和重构的潜在策略机制。该研究认为尽管通过荧光素酶报告基因实验，circFndc3b 可能确实与 miR-298-5p、miR-412-3p 和 miR-93-3pm 结合，但 circFndc3b 在内皮细胞和成心肌细胞中都不作为 miRNA 海绵来发挥作用。而且这些 miRNA 的水平在心肌梗死后的心脏中经常升高而不是降低。

我们可以看出，同一癌症可以由不同 circRNA 通过不同的途径影响其发生发展，海绵作用是各种癌症发生发展的重要机制之一。circRNA 发挥其海绵作用的机制，一方面是通过抑制或减少 miRNA 发挥作用，另一方面与 miRNA 结合后，可能通过某种反馈机制刺激，反而增加了相应 miRNA 的表达。海绵作用可能是部分 circRNA 的主要功能，但即使含有 miRNA 结合位点，也不一定通过其发挥作用。

此外，人工合成 circRNA 海绵治疗癌症或其他疾病的研究也开始了有益探索。Liu 等[4]使用 T4 RNA 连接酶 1，对线性 RNA 进行 5'-3' 端连接实现环化，人工合成含有 miR-21 结合位点的 circRNA。这些人工合成的 circRNA 抑制 miR-21 对下游蛋白靶点的活性，包括肿瘤蛋白 DAXX，抑制癌细胞的增殖。Wang 等[57]设计并构建了一个包含 miR-21 和 miR-93 结合位点的 circRNA，抑制了内源性 miR-21 和miR-93，促进了食管癌细胞凋亡，显著抑 制细胞的增殖和迁移。Jost 等[5]设计的人工体外转录和连接的 circRNA 海绵，可以从 HCV 中分离 miRNA-122，还可以作为蛋白海绵，与隔离丙型肝炎病毒繁殖所需宿主因子的序列，甚至病毒蛋白本身结合，从而抑制 HCV 增殖。尽管如此，无论是在体外合成的 circRNA，还是潜在的基于质粒的表达构建物，在体内生成人工 circRNA，都需要通过适当的传递平台进入细胞。如脂质纳米颗粒（LNPs）和合成纳米颗粒目前仍是克服 RNA 治疗细胞屏障的最佳 选择。

除了与癌症相关疾病外，Hall 等[3]研究认为 circ_Lrp6 是细胞内的调节剂和 miR-145 的天然海绵，阻碍了 miR-145 介导的 VSMC 迁移、增殖和分化的调控，可能在血管发病机制中发挥作用。

2 circRNA 的翻译作用

有报道称，一些含有内核糖体进入位点元件（IRES）或原核核糖体结合位点的环状 RNA 可以编码不同于其典型对应物的蛋白质[1]。Yang 等[63]首次报道了 RNA 最丰富的碱基修饰 n6-甲基腺苷（m6A）促进了circRNA 在人类细胞中蛋白翻译的高效起始。此外，m6A 驱动的 circRNA 翻译被发现是广泛的，数百种内源性 circRNA 具有翻译潜力，提示 circRNA 衍生蛋白在细胞对环境应激反应中发挥作用。

Xia 等[64]发现了一种新 AKT 转录本变体 Circ-AKT3。Circ-AKT3 利用重叠的启止密码子编码了一种 174 个氨基酸（aa）的新蛋白 AKT3-174aa。与配对的邻近正常脑组织相比，Circ-AKT3 在胶质母细胞瘤（GBM）组织中表达水平较低。AKT3-174aa 过表达降低了 GBM 细胞的增殖、耐辐射能力和体内致瘤性，而 circ-AKT3 的下调则增强了星形细胞瘤细胞的恶性表型。AKT3-174aa 竞争性地与磷酸化的 PDK1 相互作用，减少 AKT-thr308 磷酸化，并在调节 PI3K/Akt 信号强度中起负调控作用。

3 融合环状 RNA

2016年，Guarnerio 等[65]发现了融合环状 RNA（fusion circRNAs，f-circRNA）的存在。我们知道，在一些疾病中，非同源染色体可发生部分重排，从而将两个原本分离的基因连接在一起，形成“融合基因”，并表达融合蛋白。在研究了 PML/RARα、MLL/AF9 等多个白血病染色体易位的情况后发现，融合基因在转录后剪接生成线性融合 mRNA 时，在易位的断点区域上、下游内含子中含有互补序列（如 alu 序列）时，可以通过反剪接形成一个或多个不同的跨越断点区域的新环状 RNA，即所谓 f-circRNA。而且这些 f-circRNA 是促进细胞转化的原癌性 RNA，可触发细胞增殖速度的增加并形成病灶，在体内对白血病进展起促进作用，并增加了白血病的耐药性。但 f-circM9 本身可能不足 以引发肿瘤发生，可能需要额外的致癌因素。此外，在 SK-NEP-1 肉瘤细胞株和 H3122 肺癌细胞株中也发现有 f-circRNA。此后，f-circRNA 开始引起人们的关注。

2018年，Babin 等[66]使用 CRISPR/Cas9 技术来诱导特定的染色体易位，证明新形成的易位可以直接表达转录自 NPM1-ALK 断点的特定 f-circRNA。在 ALCL 患者的肿瘤细胞系中发现的 f-circRNA 也在不同的易位模型中被发现。这些结果表明使用 CRISPR/Cas9 诱导原位易位，可以获得相关的癌症模型，包括新生 f-circRNA 的表达。

最近，Tan 等[67-68]在非小细胞肺癌（NSCLC）融合基因 EML4-ALK 变体 3b(v3b) 中发现了两种融合环状 RNA：F-circEA-4a 和 F-circEA-2a。F-circEA-4a 可在 eml4-alk 阳性的 NSCLC 患者血浆中检测到，可作为潜在的液体活检生物标志物。而 F-circEA-2a 虽然对细胞增殖影响不大，但促进了非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭，表明环状 RNA 在 eml4-alk 阳性非小细胞肺癌中的重要作用。Wu 等[69]也证实 NSCLC 融合基因 SLC34A2-ROS1 产生的融合环状 RNA F-circSRs 能够促进肺癌细胞迁移。

从有限的研究中可以看到，f-circRNA 协同融合蛋白，在一些肿瘤的发展进程中起促进作用。f-circRNA 是否具有普通 circRNA 的海绵吸附、翻译等作用，或者具备普通 circRNA 不具备的特殊作用还有待进一步探究。

4 总结

众多研究表明，circRNA 具有 miRNA 海绵作用，与肿瘤等疾病的发展密切相关。circRNA 海绵作用的研究中，相当一部分是基于微阵列芯片筛查的结果，找出表达升高或降低的 circRNA，然后探究这些 circRNA 对肿瘤细胞的作用。遗憾的是对同种肿瘤，不同团队使用不同芯片得出的结果可能完全不同，尽管这并不意味着结果的不准确。且上述研究中，促癌作用全部是表达升高的 circRNA，抑癌作用全部是表达降低的 circRNA。虽然现有研究还未支持这种情况，但是否应该存在这种可能：虽然表达升高，但起抑癌作用。而且一种肿瘤可以对应数种 circRNA，它们之间是什么关系，如果同时使用几种 circRNA 处理肿瘤，是否可以收到更好的效果？circRNA 因为闭合环状这一结构特点而被分为一大类，但其来源、产生方式、功能、体内分布等可能完全不同，是不是应该有更科学细致的分类，是否具有不同作用的 circRNA 应该自成一类？这些都是 circRNA 研究中需要思考和解决的问题。