不同组织处理方法对流式检测结果的影响

张雪，刘清，阿尔孜古丽·吐尔逊

作者单位：830054 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院

流式细胞检测技术，结合了单克隆抗体技术、定量细 胞化学技术和定量荧光细胞化学，可对特定细胞及颗粒进行定性及定量分析，因操作简便、重复性好、结果可靠，已 在生物学、临床医学、药学等学科中得到广泛的应用[1]。流式细胞进行检测和分析的前提，是必须以单细胞为基础，因此制备出合格的单细胞悬液对流式分析的成败至关重要。本实验利用流式检测所用不同抗体，考察单细胞悬液的三组 不同处理方法对流式检测结果的影响，探讨三种方法的优缺点[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年昆明白小鼠 15 只，雄性，体质量 20 g，由新疆医科大学实验动物科学部提供；合格证号：SYXK（新）2018-003；饲养环境：SPF。

1.1.2 实验仪器 AriaII 流式细胞仪购自美国 BD 公司；DK8D 恒温水浴锅购自上海精宏公司；5424R 台式离心机购自德国 Eppendorf 公司；YS100 普通光学显微镜购自日本尼康公司。

1.1.3 实验试剂 0.1% 胶原酶、PBS 均购自上海生工生物工程有限公司；红细胞裂解液、CD45-FITC 和 CD3-PE 抗体均购自美国 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 脾组织标本取材 将小鼠处死，每组 5 只，开腹取出脾脏并分为酶消化法（A 组）、机械法（B 组）、化学处理法（C 组）3 组，分别用不同的方法制备脾细胞悬液，并且用 7AAD 抗体标记死细胞，判断细胞活性。

1.2.2 脾单细胞悬液制备 将 A 组脾组织剪碎，放入 1.5 ml 离心管中，加入 1 ml 配置好的胶原酶稀释液，将离心管置入 37 ℃ 的恒温水浴锅中振荡消化 20 ～ 30 min，期间每隔 5 分钟用吸管将管中的细胞轻柔吹打均匀并观察消化情况，将消化后的细胞悬液通过 300 目过滤器移入离心管中；将 B 组脾脏用眼科剪剪碎，加入 15 ml PBS，并用研磨器研至匀浆，移入离心管中，1200 r/min 离心 5 min，再用 PBS 洗 3 次，经滤器（300 目）过滤至离心管中；将 C 组离心管中加入 5 ml 0.2% EDTA 液，将镊子撕开的脾组织放入，消化 30 min（室温），离心弃上清，继续加入配置好的胰酶-EDTA 液 5 ml，37 ℃ 的恒温水浴锅振荡 30 min，经 300 目滤网过滤，1000 r/min 离心 5 min，如此反复冲洗 2 ～ 3 次，计数，调整三组单样本细胞浓度 1 × 106个/ml。

1.2.3 流式细胞仪测定脾单细胞悬液白细胞 CD45、T 淋巴细胞 CD3 及死细胞 7AAD 表达量 取 3 个流式检测管，分别取 A、B、C 三组单细胞悬液 100 μl 加入流式检测管，不加抗体只做裂红处理，设为空白对照组；其余每组设立 5 个复孔，每个试管分别加入 5 μl CD3-PE 及 CD45-FITC 抗体混匀，室温避光反应 20 ～ 30 min；各管中加入 1:100 稀释的裂解液 2 ml 裂红 5 min；PBS 冲洗，1000 r/min 离心 5 min，弃上清，每个样本上机前分别加入 5 μl 7AAD，再加入 0.5 ml PBS 重悬，上机进行检测。

1.3 统计学分析

实验数据采用 SPSS17.0 统计软件进行数据分析，实验数据以± s表示，三组间比较采用多因素方差分析，检验水准为 0.05，以 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

本实验对雄性昆明白小鼠脾脏组织进行取材，采用不同处理方法制备成为单细胞悬液，进行抗体标记，其中白细胞表达 CD45，T 淋巴细胞表达 CD3，死细胞表达 7AAD；经流式检测后得出（表 1）：A 组酶消化法制备的单细胞悬液，细胞团块较少，细胞存活率较好，为（81.4 ± 3.1）%，淋巴细胞中 CD3 抗体表达率为（37.2 ± 1.9）%，白细胞 CD45 抗体表达率为（89.3 ± 1.6）%；B 组机械研磨法制 备的单细胞悬液，细胞团块较多，细胞存活率仅为（57.9 ± 2.8）%，淋巴细胞中 CD3 抗体表达率为（35.6 ± 2.2）%，白细胞 CD45 抗体表达率为（60.3 ± 2.1）%；C 组化学处理法制备的单细胞悬液，细胞团块较少，细胞存活率低为（66.2 ± 1.9）%，淋巴细胞中 CD3 抗体表达率为（36.1 ± 2.2）%，白细胞 CD45 抗体表达率为（55.1 ± 2.9）%； 三组在应用不同方法制备所得的组织单细胞悬液在细胞得率、细胞存活率上及白细胞 CD45 抗体表达率存在不同 程度的差异（P ＜ 0.05），见表 1、图 1、图 2；三组在淋巴细胞中 CD3 抗体表达上无明显差异（P ＞ 0.05），见表 1、图 3。

表1 不同方法制备小鼠脾脏组织单细胞悬液的流式结果比较

图1 A、B、C 三种不同处理方法 CD45 表达

图2 A、B、C 三种不同处理方法的细胞存活率（7AAD 阴性表达）

图3 A、B、C 三组不同处理方法 CD3 表达

3 讨论

流式细胞技术由于操作简便快速、节省样本和结果可靠，已在免疫学、细胞分子生物学等研究中得到广泛的应 用[3]。流式细胞技术是通过检测细胞及微粒，分析单个细胞及微粒的不同特性，其必须基于单个细胞进行参数分析，因此制备出合格的单细胞悬液对流式分析的成败至关重要。为了达到细胞产量高、损伤小的目的，必须选择合适的细胞分散方法[4]。

本研究以小鼠脾脏为标本，选用机械研磨法、酶消化法及化学处理法分别制备单细胞悬液进行实验，通过对细胞形态学观察、细胞计数和流式检测可知：三组方法均能获得单细胞悬液，但细胞碎片和团块、细胞存活率及抗体表达率均有所差异。由此可以得到结论：在一定处理时间内，如果需要获得单细胞产率高，样本细胞数要求较多的实验，可以采 用酶消化法；而预得到无粘连的、悬浮状态良好的单细胞，对细胞得率要求不高，则可以采用化学处理法处理；单纯机械研磨法细胞碎片和组织碎片及细胞团块较多，细胞得率及细胞存活率均较低，但胜在易于操作，速度更快。本研究结果与以往的研究不同的是，通过不同处理方法，所得到淋巴细胞比率与白细胞比率的差异性并不同步，三种方法 CD3 所占淋巴细胞百分比无明显差异，而白细胞所占比率有显著性差异，这就为脾脏组织的单细胞悬液制备及流式测定提供了方法学参考。就免疫细胞检测而言，酶消化法可以获得更理想的单细胞悬液及检测数据，但由于实体组织单细胞悬液的制备目前尚缺乏通用的方法，不同组织所适用的方法也不尽相同，甚至同一组织由于实验目的的不同，所用方法也不尽相同，所以如何选择合适的单细胞悬液制备方法以获得所期望的样本和更好的流式检测结果，有待通过多种方法的不同组合并结合形态学的评价才更为准确[5]。