管碟法测定抗生素效价影响因素与控制方法的研究进展

2020-11-10 04:41任仲丽张秀花王静李秀菊刘博
中国当代医药 2020年25期
关键词:准确性影响因素

任仲丽 张秀花 王静 李秀菊 刘博

[摘要]管碟法是目前国内外常用的抗生素微生物检定法,方法经典成熟,灵敏度高,能直观地反映抗生素药品的抗菌活性。本文通过查阅资料及实际操作经验总结,对管碟法测定抗生素效价的影响因素进行分析、归纳,并提出合理有效的解决方案,旨在减少外界与人为因素引起的误差,使测定结果与真实值更为接近,使试验的准确性得到有效提高。

[关键词]管碟法;抗生素效价;影响因素;准确性

[中图分类号] R927.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721(2020)9(a)-0027-04

[Abstract] The cylinder-plate method is a commonly used method for microbiological assay of antibiotics at home and abroad. The method is classical and mature, with high sensitivity, and can directly reflect the antibacterial activity of antibiotics. This paper analyzes and summarizes the factors influencing on the assay of antibiotic microbiological by cylinder-plate method through data review and practical experience summary, and puts forward reasonable and effective solutions to reduce the errors caused by external and human factors, so that the measurement results are closer to the real value and the accuracy of the test is effectively improved.

[Key words] Cylinder-plate method; Antibiotic microbiological assay; Influence factors; Accuracy

《中華人民共和国药典》2015年版(ChP 2015)四部通则[1]1201抗生素微生物检定法包括管碟法和比浊法,其中管碟法测定的品种共35个,是目前国内外常用的抗生素微生物检定法,利用抗生素溶液在含有特定试验菌的琼脂培养基内成球面形扩散,一定时间内,试验菌的生长与抗生素溶液的扩散达到动态平衡,琼脂培养基上呈现透明的抑菌圈[2],抗生素浓度对数剂量与抑菌圈直径呈直线关系,通过比较标准品与供试品产生的抑菌圈直径大小,计算出供试品的抗生素效价[1]。

管碟法以扩散原理为基础,因此与扩散作用有关的因素,如扩散系数、扩散时间、抗生素溶液的浓度等因素都影响测定结果的准确性[3]。本文按照试验的步骤(图1),就影响管碟法的重要因素进行归纳,并提出合理有效的解决方案,减少外界与人为因素引起的误差,使测定结果与真实值更为接近,提高试验的准确性[2]。

1环境

操作室应分两部分:一部分为一般操作区,另一部分为半无菌操作区,其中半无菌操作区温度应控制在20~25℃,空气净化级别至少为万级,并设有紫外线灭菌灯或其他灭菌设备。操作台面应定期进行水平检查,避免由于操作台面不水平而造成培养基厚薄不均,影响后续试验[4]。建议使用生物安全柜。

2试验器材的准备

与试验有关的所有试验器材都必须经过严格的灭菌,移液管、滴定管、容量瓶等玻璃容器应进行标定,并符合A级要求;天平应满足品种称量的精度要求,进行检定并符合规定[2]。

2.1双碟

建议选用同厂家、同批次产品。试验时应挑选碟底厚薄均匀,水平透明,无色斑气泡的双碟,避免因底面的凹凸不平造成培养基厚薄不均。可将双碟放在水平台面上,下垫一张白纸,双碟内加水2~3 ml,再滴加蓝墨水,根据蓝色深浅是否一致来判断双碟底面是否平整。

2.2钢管

建议选用内外壁及两端平坦、光滑、管壁厚薄均匀一致的,且为同一厂家的同一最小包装产品,使钢管在培养基中沉降深度相同,溶液扩散均匀一致;若两端不平坦,溶液容易侧漏[5]。钢管的清洁也是影响试验成败的关键因素,如果钢管残留微量抗生素或被其他杀菌剂污染,会使抑菌圈破裂,因此钢管的清洗一定要彻底。被污染的钢管应用清洁液浸泡2 h后,再用蒸馏水或纯化水清洗干净,灭菌后方可使用,逐个称量仍能使用的钢管,按重量分套(每套钢管重量差异不超过±50 mg)使用[6-7]。曾东方等[8]的研究采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯进行简易试验。

2.3滴管

试验时挑选管口光滑,口径大小适当,垂直滴下时液滴大小以每毫升20滴为宜。使用前在清洁液中浸泡不少于24 h,然后用蒸馏水或纯化水冲洗3次,置适当容器中,150~160℃干热灭菌2 h备用。

3供试品、标准品、缓冲液与培养基的准备

用于菌种传代的培养基及抗生素检定培养基的来源对抗生素效价测定均有影响,因此通常需进行预试验以确定最佳的试验条件[9]。

3.1供试品、标准品

供试品与标准品称量的不确定度对抗生素效价测定有一定的影响,称量前先将标准品从冰箱中取出,使其温度与室温达到平衡;供试品与标准品的称量应使用同一天平;尽量一次性称取,建议供试品称取量不少于50 mg,标准品称取量不少于20 mg[10-11]。供试品与标准品的溶解稀释的不确定度对抗生素效价测定的影响较大,因此《中国药品检验标准操作规范》(2019年版)中“抗生素微生物检定法”相关要求规定,玻璃容器均应符合《常用玻璃量器检定规程》里的A级要求,每步稀释取量不得少于2 ml,总稀释步骤一般不超过3步[11-12]。按ChP 2015规定,供试品水解可以采用40℃放置6 h或室温放置16 h。中国合格评定国家认可委员会(CNAS)《抗生素微生物检定法测定药品含量》能力验证(T0426)对85家实验室进行统计,发现两种方法无显著差异,但是供试品和标准品应采用同种水解方法,并严格按照规定的温度和时间放置,否则即为对标准方法的偏离[4]。

3.2缓冲液、培养基

配制缓冲液与培养基时要严格按照说明书的要求配制,配制缓冲液的试剂应为分析纯的化学试剂,培养基来源应相对固定,严格按照要求的pH值进行调节,由于pH值的不同可能会出现卵圆形抑菌圈,培养基酸碱度会显著的提升或抑制抗生素的杀菌作用,碱性条件下,抗生素甚至失去杀菌作用[13-14]。姚永青等[9]研究发现由于国内培养基质量参差不齐,应对培养基质量进行严格控制,在用管碟法做抗生素效价测定时,应选择最适传代培养基与检定培养基作为试验的系统适用性条件。

4试验菌的制备

试验菌株特性发生变异,也会严重影响结果的准确性,ChP 2015明确规定试验菌应使用标准菌株,并规定了菌株编号和菌悬液的制备方法,保证制备菌悬液的菌株在3~5代,并采用适宜的菌种保藏技术保存菌悬液及菌种培养物,保证试验菌株的生物学特征不变[15]。试验菌株的菌龄不等,会导致抑菌圈的扩散系数不均匀,进而导致抑菌圈的边缘不清晰,这也是影响试验结果的重要因素之一[14]。

菌液的复苏也是试验成败的关键因素,要掌握好复苏时间,过短菌种没有苏醒,过长菌种又进入了休眠状态[10]。试验菌菌种浓度过小,抑菌圈边缘模糊不清;浓度过大,抑菌圈太小,因此在不能掌握菌种浓度的情况下,可以先做一下预试验[16-17]。

5试验操作

5.1制备双碟

加注底层培养基,体积控制在20 ml。底层培养基太少,抑菌圈过大,底层培养基太多,钢管会被陶瓦盖压入菌层培养基,导致液体无法渗出。加注菌层培养基时应将培养基放在水浴中保温,细菌控制在48~50℃,芽孢控制在60℃,菌层培养基体积为5 ml,加注时要迅速转动双碟使培养基均匀平铺开[2]。环境温度对培养基的均匀铺开有较大的影响,温度太低很容易造成培养基没有扩散开已凝固,应控制在20~25℃[12]。由于管碟法的可信限率不好控制,往往需增加培養基数量才能获得规定的可信限率,最好多制备几个双碟,一般制备10个[18]。

5.2放置钢管

放置钢管要从同一高度平稳、垂直放置,相应剂量的钢管对角均匀放置,且注意钢管与钢管,钢管与双碟边缘的距离,依个人实践经验,建议使用钢管自动放置器,钢管在琼脂培养基上静置5~10 min沉降稳定后,再滴加抗生素溶液[12]。

5.3滴加抗生素溶液

常艳等[19]研究发现试验中按照SH→TH→SL→TL的顺序,先滴加标准品溶液时,测定结果偏低;按照TH→SH→TL→SL的顺序,先滴加供试品溶液时,测定结果偏高;且差值(PT测定-PT真值)均随滴加抗生素溶液时间的延长而增大;建议采用两组试验按两种顺序平行试验,消除滴加抗生素溶液顺序引入的系统误差,并对试验结果进行合并计算。

滴加抗生素溶液时,滴管应和钢管保持适当的距离,不宜离管口太高,以防溶液溅出,滴落在培养基表面;亦不宜过低,以防触碰钢管,使钢管与培养基分离[14]。用滴管加样时,管口不宜过大,管口过大液滴容易封闭钢管,底部气体无法移出,导致无圈;加样量一定要适量,滴加量过多溢出导致抑菌圈不圆,量太少则抑菌圈直径达不到18~22 mm。滴加时间不易过长,因为钢管内溶液扩散时间不同,会影响测量结果的准确性[13]。邰顺章等[20]通过利用自制玻璃滴管、1 ml卡介苗注射器、微量移液器3种加样方法比较,发现采用微量移液器定量加样,能高效的控制扩散时间和加样量,回归和可信限率都有明显的提高,偏离平行略有提高。蒋惠岚[21]研究发现当用微量移液器加抗生素溶液时,加270 μl抗生素溶液最合适,可以获得满意的可信限率(≤5%),误差更小,并可节约大量时间。常艳等[19]研究发现管碟法以每组10个培养皿计,当点样时间控制到10 min以内时,测定结果与真值极为接近,可以忽略因点样时间引入的误差,因此建议点样时间最多不超过10 min。

6双碟的培养

滴加了抗生素溶液的双碟要轻拿轻放,双碟要与培养箱保持一定的距离且双碟叠放不能超过3个,保证双碟的温度一致,使试验菌生长速度一致,减小试验误差[2]。

7抑菌圈的测量

使用抑菌圈自动测量仪测量结果时,抑菌圈清晰度对测量结果影响非常大,建议试验时根据具体的明暗程度,调节抑菌圈自动测量仪的清晰度[10]。抑菌圈自动测量仪是应用光电转换、光耦合装置(CCD)扫描、模数变换(AD变换)等技术,通过测量抑菌圈直径,折算出抗生素效价含量的仪器,测量结果由计算机直接输出,但多数生产厂家并没有给出效价测定的技术要求,因此,应对仪器进行检定校准的方法研究,用以评价测量系统的性能[22]。试验所用的抑菌圈自动测量仪应每年或每半年定期进行图像、回收率试验误差、重复测量的精密度等指标校准[7]。常艳等[19]研究发现,不能正确计算估计效价(AT)和浓度比(D)会导致结论由不符合规定变为符合规定,或者相反。

8小结

管碟法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法,在各国药典中被普遍采用,随着高效液相色谱法(HPLC)等化学分析技术的快速发展,很多抗生素品种已使用化学分析方法测定效价,但管碟法能够直观、特异性地反映抗生素的抗菌活性,与临床具有一致性,因此在各国药典中仍占有重要的地位[9]。

本文通过对管碟法测定抗生素效价的影响因素进行归纳,提示试验人员在操作过程中,严格按照操作规范,谨慎小心操作,减少外界与人为因素引起的误差,使测定结果与真实值更为接近,提高试验的准确性。

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(收稿日期:2020-03-27  本文编辑:孟庆卿)

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