两种抗生素对携带Wolbachia的短管赤眼蜂生殖模式的影响

张美娇，王 轩，李远玉，林良冠，潘志萍，何晓芳*

(1.华南农业大学农学院昆虫学系，广州 510642；2.广东省科学院动物研究所，广州520620)

Wolbachia是一种常见的细胞内共生菌，自然界中66%节肢动物感染了Wolbachia(Hilgenboecker, 2008)。在长期的进化过程中，Wolbachia拥有了以下调控宿主生殖方式的能力：导致宿主的胞质不相容、诱导孤雌生殖、导致雄性个体的雌性化、雄性致死性、增强繁殖力等(Stouthameretal.，1990；O’Neilletal.，1992；Girinetal.，1995；Hurstetal.，1999；Stouthameretal.，1999)。

赤眼蜂TrichogrammaWestwood的性别决定为单倍/双倍体型(Heimpel & Boer，2008)。无雌雄交配条件下，产生单倍体的雄蜂。有雌雄交配条件下，产生双倍体的雌蜂。但一些赤眼蜂在感染Wolbachia后，会由产雄孤雌生殖转变为产雌孤雌生殖(Stouthameretal.，1990)。由于在生产应用上，仅饲养雌蜂比饲养两种性别的赤眼蜂节约更多的生产成本;而且在田间释放时，具有产雌孤雌生殖能力的赤眼蜂更利于建立田间种群。如何利用Wolbachia对赤眼蜂生殖调控则向着更节约、更高效的目标进行研究。因此，不少研究都想获得更多的产雌孤雌生殖的赤眼蜂品系。

短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum是南美洲地区应用最广泛的天敌寄生蜂。尤其在发现Wolbachia对短管赤眼蜂具有诱导产雌孤雌生殖的行为调控现象后(Stouthamer & Kazmer，1994)，其调控机制一直是个研究热点问题(Rijesh，2014；Russelletal.，2018)。目前短管赤眼蜂的基因组及其体内感觉的Wolbachia基因组都已经公布(Lindseyetal.，2016；Lindsey，2017；Lindseyetal.，2018)，但是具体的机制仍待研究。其中一个最关键的问题是获得阴性的无感染Wolbachia短管赤眼蜂品系作为阴性对照是一系列研究的必要条件。

在之前的报道有利用四环素和高温分别对多种赤眼蜂体内的Wolbachia进行处理，以消除其体内的Wolbachia，获得阴性的无感染Wolbachia赤眼蜂品系。但是多位研究者的实验结果表明，四环素和高温并不能完全去除短管赤眼蜂体内的Wolbachia或获得100%的孤雌产雄后代(Stouthameretal.，1990；潘雪红和何余容，2010；陈茜等，2016；董辉等，2016；张志凌，2016；宁素芳，2017)。

环丙沙星(ciprofloxacin)和磺胺嘧啶(sulfadiazine)均为广谱抑菌剂。其中环丙沙星通过抑制细菌DNA解旋酶，阻止细菌复制而达到抑菌作用(Davisetal.，1996)。环丙沙星对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖甙类和四环素类耐药菌珠均具有较高抗菌能力。磺胺嘧啶抑菌原理主要是与细菌体内的二氢叶酸合成酶结合，阻止正常的氨基苯甲酸(PABA)作为原料合成细菌所需的叶酸，进一步减少了细菌DNA的合成，从而抑制细菌的生长繁殖(García-Galánetal.，2008)。磺胺嘧啶对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用。

本实验利用两种抗生素环丙沙星和磺胺嘧啶的3个浓度对短管赤眼蜂进行了处理，观察短管赤眼蜂孤雌产雄的生殖方式是否发生改变，能否获得完全孤雌产雄的后代，从而为进一步研究Wolbachia在对短管赤眼蜂生殖性别调控的机制提供条件。

1 材料方法

1.1 供试昆虫

试验短管赤眼蜂种群购自美国，通过雄外生殖器特征进行形态鉴定及ITS2测序分子鉴定(Stouthameretal.，1998)。体内的Wolbachia利用wsp特异引物进行扩增及测序鉴定(Baldoetal.，2006)。在恒温培养箱内25℃，相对湿度为70%～80%，光周期为16 L ∶8 D的条件下用米蛾卵Corcyracephalonica繁殖，经过多代饲养，稳定繁殖。

1.2 试剂配制

环丙沙星，磺胺嘧啶购于广州健阳生物公司。利用两种抗生素的3个浓度对短管赤眼蜂进行了处理，将环丙沙星、环丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1、磺胺嘧啶分别用30%蜂蜜水稀释为0.1 mg/mL、1.0 mg/mL、10 mg/mL的抗生素蜂蜜水。

1.3 抗生素对短管赤眼蜂生殖行为的影响

由于原短管赤眼蜂为孤雌产雌种群，不存在雄性个体。因此选择在雌蜂羽化后进行单蜂繁殖建立本实验种群。在体视镜下用小毛笔取出刚羽化的短管赤眼蜂雌蜂，单头放入指形管内，分别饲喂含有3种抗生素蜂蜜水。并设置30%蜂蜜水无抗生素为对照组。饲喂24 h后放入不少于100粒已灭胚的新鲜米蛾卵制作成的卵卡进行产卵寄生。寄生24 h后用小毛笔挑出赤眼蜂放入离心管于-30℃保存。带有被寄生卵卡的指形管继续放入气候箱培养，温度25℃，相对湿度80%～85%，光照条件14 L ∶10 D。每个处理进行3组重复。连续处理2代，记录F0和F1代处理米蛾卵变黑个数即赤眼蜂产卵量，F1和F2代的羽化、雌性、雄性和雌雄镶嵌体个数，计算羽化率、雌雄性比。分析试验数据用SPSS 24.0软件，采用one-way ANOVA和Duncan’s进行多重比较，不同世代间(F0与F1或F1与F2)的数据采用t检验进行分析。各参数统计计算如下：

产卵量的计算：接蜂后的第7天计录下每张卵卡上变色(黑)的卵粒数作为单头雌蜂的产量卵。

羽化率的计算：当小试管中出现成蜂开始记录所有羽化的成蜂头数，以成蜂数/产卵量×100%作为羽化率。

产雄率的计算：每代的蜂死亡后，在100倍体视镜下根据触角形态特征和腹部是否具有产卵器来区分雌雄。触角毛较长，其中最长的触角毛是鞭节最宽处的2.5倍，作为雄性的主要外部形态特征。雌蜂触角毛较短，腹部具有产卵器。雌雄相嵌体的判断依靠触角的特征与是否具有产卵器的特征进行区分，如果有产卵器但触角表现为雄性特征或无产卵器但触角表现为雌性的个体都判断为雌雄相嵌体。

产雄率(%)=雄性个体数/总羽化个体数×100

雌雄相嵌体比率(%)=雌雄相嵌体个体数/总羽化个体数×100

2 结果与分析

2.1 抗生素对短管赤眼蜂产卵量的影响

多组抗生素处理中除10 mg/mL的环丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1处理呈现出F1代比F0代的产卵量显著高以外(t=-3.18，P=0.04)，其余各处理在世代间的产卵量没有差异(表1)。与对照组仅喂食蜂蜜水相比，喂食抗生素与蜂蜜水混合的F0代在产卵量上产生了各种变异。环丙沙星处理产卵量比对照具有高的产卵量，而且呈现浓度低的处理产卵量比浓度高的处理更高的产卵量。虽然这些差异并没达到显著水平。与对照组相比，含有磺胺嘧啶的6个处理获得的产卵量都偏低，尤其0.1 mg/mL的环丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1处理的产卵量显著地低于对照组(df=6，F=2.39，P=0.01)(表1)。

2.2 抗生素对短管赤眼蜂羽化率的影响

各处理在世代间的羽化率仅在0.1 mg/mL的环丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1处理的F2代显著地低于F1代(t=4.27，P=0.01)。其它的处理在世代间没有差异。F1世代的羽化率各处理间无显著差异(df=9，F=1.08，P=0.42)。F2世代中，0.1 mg/mL的环丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1处理的羽化率显著地低于对照及其它浓度处理(df=7，F=3.03，P=0.03)(表1)。

2.3 抗生素对短管赤眼蜂子代性别的影响

抗生素对短管赤眼蜂产雄率的影响中能看出，在F1代中，所有的处理都不曾出现雄性个体。从F2代开始，含有磺胺嘧啶的处理就开始出现了雄性个体，并且当浓度达到1.0 mg/mL以上的处理中出现了100%的雄性后代，显著地高于其它的处理(df=9，F=31.93，P=0.00)。0.1 mg/mL的环丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1处理中F2代出现了1头雌雄相嵌体，其雌雄相嵌体比率与其它处理存在显著差异(df=9，F=3.31，P=0.01)(表1)。但是环丙沙星经过6代的筛选仍然未能获得雄性的后代(数据未例出)。

3 结论与讨论

在某些赤眼蜂中，Wolbachia降低了赤眼蜂的生殖力的同时(Hoogenboometal.，1998；Luck，2000；Silvaetal.，2000)，缩短寄主寿命及影响嗅觉反应等寄生行为(潘雪红等，2007；张海燕等，2013)。本论文利用前人不曾使用过的两种抗生素尝试去除了短管赤眼蜂体内的Wolbachia，并观察处理后对其生殖行为的影响。

3.1 抗生素对产卵量的影响

抗生素对赤眼蜂产卵量呈现出多种影响效果。通过四环素饲喂幼虫的方式去除短管赤眼蜂和广赤眼蜂Trichogrammaevanescens体内的Wolbachia的实验发现，去除体内Wolbachia的短管赤眼蜂呈现出较低的产卵量(潘雪红和何余容，2010)，但对广赤眼蜂的产卵量没有影响(Grenieretal.，2002)。本研究结果显示：与对照相比，环丙沙星对携带的短管赤眼蜂产卵量无抑制作用。磺胺嘧啶处理会降低F0代的产卵量，尤其当磺胺嘧啶与环丙沙星混配使用时，抑制产卵量的效果更明显。但F1代的产卵量都呈现回升。这个结果与前人多个实验结果类似。而经过多代的抗生素处理后(8代左右)，赤眼蜂的产卵量在连续的世代间会呈现出一种先降低随后又呈上升趋势波动状的影响(潘雪红和何余容，2010；董辉等，2016)。但根据长达27个世代的观察研究发现，用抗生素去除后Wolbachia的短管赤眼蜂总寄生产卵量比感染的短管赤眼蜂要低(Grenieretal.，2002)。

3.2 抗生素对短管赤眼蜂羽化率的影响

盐酸四环素处理后松毛虫赤眼蜂后代羽化率在同一盐酸四环素处理浓度下，随着抗生素处理代数的增加呈先降低后升高的趋势(董辉等，2016)。本实验仅在0.1 mg/mL环丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1处理中体现出F2代的羽化率比F1代的羽化率显著偏低外，其它的处理羽化率都不低于对照处理。

3.3 抗生素对短管赤眼蜂子代性别的影响

去除赤眼蜂体的Wolbachia，最常用的方法是高温(>30℃)和抗生素的运用。高温会降低赤眼蜂体内的滴度，导致产雌孤雌生殖的赤眼蜂在其后代中产生雄蜂或雌雄相嵌体(Tulgetske & Stouthamer，2012)。但是高温通常也会降低赤眼蜂的存活率及产卵量(潘雪红和何余容，2010)。

抗生素处理同样也可以使产雌孤雌生殖的赤眼蜂处理后代出雄蜂或雌雄相嵌体。通常使用的抗生素包括四环素(tetracycline hydrochloride)、利福平(rifampicin)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、庆大霉素(gentamycin)、青霉素(pennicillin G)、红梅素(erythromycin)等。但一些抗生素并不能使处理后的子代出现雄性个体(Stouthameretal.，1990)或只产生少量的雄性个体(张志凌，2016)。同样，本研究单独利用环丙沙星的处理不能获得雄性个体。前人的多个实验中，即使成功获得了产雄孤雌生殖的个体，但由于这些抗生素不是100%去除赤眼蜂体的Wolbachia，导致只要含有微量Wolbachia，不是100%去除Wolbachia的赤眼蜂种群中，在其后代也能恢复产雌孤雌生殖的行为(Stouthameretal.，1990)。

利用浓度高达100 mg/mL或30 mg/mL的四环素处理产雌孤雌生殖短管赤眼蜂或松毛虫赤眼蜂成虫，即使经过5代以上的处理，仍不能出现100%雄性后代，其后代雌性个代仍高达60%以上(Stouthameretal.，1990；潘雪红和何余容，2010)。本实验利用1.0 mg/mL磺胺嘧啶或利用环丙沙星与磺胺嘧啶混用对携带Wolbachia的短管赤眼蜂进行处理后，在F2代就已经出现了100%的雄性个体。这些处理主要起作用的应当是磺胺嘧啶。推荐单独利用1.0 mg/mL磺胺嘧啶对携带Wolbachia的短管赤眼蜂进行的去除Wolbachia实验，这种方法更方便、省时，并且获得完全雄性后代。