活酵母对猪大肠体外产甲烷的抑制作用

孙秀青，赵红丽

（鹤壁职业技术学院，河南鹤壁 458000）

随着对抗生素使用的日益关注，饲料添加剂（如活性干酵母）被广泛用于畜牧业，以提高动物生长性能和免疫力（仲伟光等，2018）。具有活性的干酵母也可以通过增加反刍动物丙酸浓度和产生同型乙酸的细菌数量来有效降低甲烷产量（许斌斌，2016）。瘤胃丙酸的生成可以作为氢气的竞争途径，而同型乙酸细菌可以利用二氧化碳和氢气生成乙酸，其在反刍动物消化系统氢回收中扮演重要角色。未消化的碳水化合物在猪大肠内的发酵主要产生短链脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸以及气体，如二氧化碳、氢气和甲烷。此外，从能量效率和环境角度来看，甲烷和氢气代表了能量的损失（Scheehle和 Kruger，2006）。虽然猪的肠内甲烷产量远低于反刍动物，但由于前者养殖数量庞大，有必要对减少猪的甲烷产量进行调查。本研究旨在利用体外离体发酵技术，评估两珠活酵母对猪大肠产甲烷的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试验供体及体外培养 试验选择两头平均体重为60 kg的商品猪，饲喂以玉米和豆粕为基础的日粮（表1），每天饲喂2次。饲养4周后对猪进行屠宰，收集大肠内容物作为接种物，定量转移到塑料袋中，密封，在预加热至39℃的水浴中孵育2 h。肠道内容物与缓冲液（碳酸氢钠+碳酸氢铵）按1∶3的比例混合，4层纱布过滤。

表1 基础日粮组成及营养成分

1.2 体外培育及样品分析 酵母的浓度为1.8×1010个/g，两种酵母分别以0.3 mg/mL和0.6 mg/mL的浓度添加。在两个发酵箱中分别进行两次24 h相同的孵育试验，这两个发酵箱接受相同的处理，每个处理重复3次。发酵结束后，使用气密注射器从每个发酵箱中取出约50 mL的气体样本，转移到气体采样袋中进行甲烷分析。注射器的内容物分别转移EP管并在冰箱中保存，目的是阻止进一步发酵。以3500×g离心10 min，取上清液于EP管中，-80℃保存，用于随后的挥发性脂肪酸分析。孵育残渣用30 mL蒸馏水洗涤2次，60℃干燥至恒重，称重计算体外干物质降解率。

1.3 数据计算与分析 计算乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比（mmol/100 mmol），即样品中挥发性脂肪酸的测定浓度除以挥发性脂肪酸的总浓度再乘以100。根据挥发性脂肪酸浓度和甲烷量估计氢释放和回收率（Demeryer和 Degraeve，1991）。各组试验数据均值用SAS软件单因素方差分析模型，采用Duncan’s法进行多重比较，同时研究挥发性脂肪酸浓度与甲烷产量的相关性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 活酵母对猪大肠体外发酵干物质降解和气体生成的影响 由表2可知。添加酵母后，总气产量和甲烷产量显著下降（P＜0.05），其中面包酵母组甲烷产量占比显著低于对照组（P＜0.05）。两种活酵母组甲烷降低百分比分布为10.1%和26.2%。0.6%酿酒酵母和0.3%面包酵母组干物质降解率最高（P＜0.05）。

表2 不同活酵母对猪大肠体外发酵干物质降解和气体生成的影响

表3 不同活酵母对猪大肠体外发酵挥发性脂肪酸浓度的影响

2.2 活酵母对猪大肠体外发酵挥发性脂肪酸浓度的影响 由表3可知，补充0.6 mg/mL酿酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母组丙酸、丁酸、戊酸及挥发性脂肪酸总量浓度显著高于对照组（P＜0.05），而乙酸浓度有降低趋势（P=0.09）。0.6 mg/mL面包酵母组及0.3和0.6 mg/mL酿酒酵母组丙酸、丁酸、戊酸比例显著升高（P＜0.05），乙酸比例显著降低（P＜0.05）。补充两种酵母显著降低了氢的回收率（P＜0.05）。

由表4可知，甲烷产量和乙酸占比及乙酸与丙酸比值呈显著正相关（P＜0.05），而丙酸的比例与甲烷产量有显著负相关趋势（P=0.07）。

表4 甲烷生成与挥发性脂肪酸占比的相关性

3 讨论

本研究选择的两株活酵母细胞主要是基于其增长率，结果仅显示其对猪大肠内容物体外培养潜在的甲烷生成有抑制作用（表2）。这一结果与Lynch和Martin（2002）报道的结果一致，其发现酿酒酵母降低了瘤胃甲烷生产，但Lila等（2006）用混合瘤胃菌群分批培养未发现对甲烷的抑制作用。这些结果之间的差异可能与菌株特征、日粮组成和剂量有关。本研究中酵母处理组的总产气量显著下降，而在Lila等（2006）的报道却有所增加，这可能与酵母处理中乙酸产量的下降有关，因为二氧化碳和氢气是碳水化合物发酵过程中生成乙酸的副产物。较低的甲烷量与气体总量比值表明活酵母可以降低甲烷生成量，但对气体总量的降低无显著影响。

补充0.6 mg/mL酿酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母组丙酸、丁酸、戊酸及挥发性脂肪酸总量浓度显著高于对照组，同时0.6 mg/mL面包酵母组及0.3和0.6 mg/mL酿酒酵母组丙酸、丁酸、戊酸比例显著升高。当碳水化合物发酵成乙酸和丁酸时，作为甲烷合成主要底物的二氧化碳和氢气生成，而丙酸的生成则作为有效氢气的竞争途径（Boadi等，2004）。乙酸和丁酸产量与甲烷量表现为显著正相关，以及丙酸比例与甲烷产量有显著负相关的趋势，这一结果进一步证实了活酵母可以通过提高丙酸产量来抑制甲烷生成。

Chaucheyras等（1995）体外研究表明，即使在产甲烷菌存在的情况下，补充活酵母对同型产乙酸菌利用氢气和产乙酸有有益影响。当甲烷产量降低时，氢浓度往往增加，同时同型乙酸均可以利用二氧化碳和氢气产生乙酸，这在一些非反刍动物消化系统中发酵生成氢气的再利用起重要作用。此外，硫化氢是在大肠中通过异化硫酸盐还原作用产生的，如果提供足够的硫酸盐，该反应对氢的亲和力更高，氢的阈值比产甲烷低（Zinder，1993）。虽然我们没有检测大肠内容物中的硫酸盐浓度，但Ushida等（1995）在猪盲肠内容物中检测到大约10 mmol/L的游离硫酸盐，这足以使硫酸盐进行还原反应。本研究的氢回收率仅在58%～65%之间，这可能是因为部分氢气被用于生产硫化氢。较低的氢气回收率表明，在猪后肠中存在还原性乙酸，这是乙酸的一个重要来源。此外，在本研究中，酵母处理组的氢气回收率显著下降（表3），同时，酵母补充组乙酸产量增加，甲烷产量降低，表明活酵母诱导了更高的乙酸生成。

4 结论

综上所述，本研究使用的2种活酵母是潜在的肠内甲烷生成抑制剂。与对照组相比，酿酒酵母水平越高，面包酵母水平越低，干物质体外降解率、挥发性脂肪酸总量、丙酸产量越高。本研究结果表明，活酵母细胞通过改变发酵途径，使丙酸产量高于乙酸和丁酸，从而降低氢气量。