基于响应面的成品露酒勾调及体外抗氧化研究

王 广，朱定国，，余爱民，程宏连，程 超

(1.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北恩施 445000；2.恩施硒谷科技股份有限公司，湖北恩施 445000；3.重庆市酒类管理协会，重庆 404100)

中国除了茶饮之外，大概再没有一种液体能够像酒一样让人嗜之若命，也再没有一样食品能够像中国酒一样与中华上下五千年文化一同源远流长。随着社会的不断前进、发展，中国酒也在不断地适应新的变化。从发酵酒到蒸馏酒再到露酒，从液态法发酵到固态法发酵，从高度化、烈性化、大众化到低度化、健康化、定制化等等，无不反映着中国酒的发展历程。在这一系列变化中尤以露酒最为明显，露酒作为中国酒里面重要的一种，有着举足轻重的地位。本文的复合型露酒主要以绵柔型小曲白酒为基酒[1]，桂花、绞股蓝、藤茶为主要浸泡物，它不仅具备基酒所含有的酸、酯、醛、醇等多种物质[2-3]，并且拥有扩张血管、降低颅内压力、降低胆固醇、预防心血管疾病等药理功效[4-7]，此外，被浸泡物亦具备舒适的挥发油香气[8-10]，富含黄酮、多酚、皂甙、多糖等[11-15]，具有抗氧化[16-18]，降血糖、血脂[19-21]，延缓衰老[22-24]，抗菌、消炎等诸多功效[25-28]，及其他营养功能。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品及耗材：绵柔型小曲白酒，恩施巴王酒业有限公司；藤茶（优级），湖北仙芝堂生物科技有限公司；绞股蓝（优级），湖北仙芝堂生物科技有限公司；桂花（优级），湖北仙芝堂生物科技有限公司；冰糖，上海财源来糖业有限公司；无水柠檬酸（食品级），潍坊英轩实业有限公司。

试剂：水杨酸（AR 级），国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁（AR级），天津市福晨化学试剂有限公司；30%过氧化氢（AR级），国药集团化学试剂有限公司；十二水合磷酸氢二钠（AR级），国药集团化学试剂有限公司；二水合磷酸二氢钠（AR级），国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（AR级），国药集团化学试剂有限公司；过二硫酸钾（AR级），国药集团化学试剂有限公司；ABTS（色谱级），国药集团化学试剂有限公司；DPPH（色谱级），国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：紫外可见分光光度计（UV-9000S），上海元析仪器有限公司；电子天平（d=0.1 mg），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；酒度计（0～100），德州润昕实验仪器有限公司；超纯水设备，武汉品冠仪器设备有限公司；恒温水浴锅（SG），上海苏豪智能系统有限公司；超声波清洗仪（30 L），上海贝凯生物化工设备有限公司；Design-Expert 软件，8.0.5b版本。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程（图1）

1.2.2 实验操作关键点

（1）实验的露酒原酒配方主要以前期预实验结果为依据，并同时结合浸泡产生的露酒感官品评（为主）而确定的配方。

（2）勾调时对露酒原酒先进行自然澄清操作；冰糖先配制成30.00%（m/v）溶液后再添加；柠檬酸配制成10.00%（m/v）溶液后添加。

（3）勾调配方过程中保证露酒原酒和调味剂比例（冰糖、柠檬酸）均以总体积确定，不足部分用蒸馏水补足100%。

（4）单因素试验及成品露酒评价标准以感官品评为准（100 分制），为避免误差将最低分控制在75分以上，最终得分为平均分。

（5）感官品评环境为：温度16～26 ℃，湿度40%～70%，噪声小于40 dB，灯光色温6500 K，品酒杯容量50～55 mL、最大液面处容量15～20 mL的郁金香杯，品酒时间上午9:00—11:00。

1.2.3 优化配方的单因素实验

1.2.3.1 冰糖用量优化试验

基酒用量为50.00%，柠檬酸用量0.05%，冰糖添加量为2.00%、4.00%、6.00%、8.00%、10.00%。

1.2.3.2 基酒用量单因素试验

柠檬酸用量为0.05 %、冰糖用量为6.00 %，基酒用量为30.00 %、40.00 %、50.00 %、60.00 %、70.00%。

1.2.3.3 柠檬酸用量优化试验

冰糖用量为6.00 %、基酒用量为50.00%，柠檬酸添加量为0.03 %、0.04 %、0.05 %、0.06 %、0.07%。

1.2.4 配方的响应面优化

依据1.2.3 中单因素的实验结果，利用响应面设计软件（Design Expert）生成实验设计参数表1，成品配方响应面实验因素及水平。

表1 Box-Behnken Design实验因素及水平

1.2.5 复合露酒对DPPH自由基的清除作用

配制2 mmol/L 的DPPH 溶液备用；将样品稀释为100 倍、500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍后备用。取5 支洁净的带塞试管，依次加入2.00 mL 不同稀释浓度的样品溶液、2.00 mL DPPH 溶液，混合均匀后避光静置30 min，然后在517 nm 测定吸光度值，DPPH自由基的清除率按照公式1计算[29]。

式中：Ac——2.00 mL DPPH 溶液+2.00 mL 无水乙醇溶液在517 nm处的吸光度值。

Ai——2.00 mL样品溶液+2.00 mL DPPH溶液在517 nm处的吸光度值。

Aj——2.00 mL 样品溶液+2.00 mL 无水乙醇溶液在517 nm处的吸光度值。

1.2.6 复合露酒对ABTS+·自由基的清除作用

ABTS+·储备溶液制备：取5.00 mL 7 mmol 的ABTS+·溶液、88.00 μ L 140 mmol 的过硫酸氢钾，混合均匀，避光贮存过夜，得ABTS+·储备液，使用前用45%vol 乙醇稀释至734 nm 吸光度值为0.70±0.02。

样品测定：将待测样品依次稀释为500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍、2500 倍后备用；取洁净的带塞试管，依次加入1.00 mL 稀释的样品、3.00 mL ABTS+·储备溶液，混合均匀、反应6 min后在734 nm处测定其吸光度值[29]。并按照公式2 计算ABTS+·的清除率。

式中：A0——1.00 mL 缓冲溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm处的吸光度值。

A1——1.00 mL 样品溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm处的吸光度值。

A2——1.00 mL 样品溶液+3.00 mL 缓冲溶液在734 nm处的吸光度值。

1.2.7 复合露酒对·OH自由基的清除作用

溶液制备：9 mmol 硫酸亚铁的制备，精确称取2.50 g 的硫酸亚铁并定容到1 L，备用；9 mmol 水杨酸的制备，精确称取1.243 g 的水杨酸，并用无水乙醇溶解、定容到1 L，备用；8.8 mmol 的过氧化氢溶液制备，量取0.90 mL 的30 %过氧化氢溶液于1 L棕色容量瓶中，并定容备用。

样品测定，按照表2 依次加入样品及反应溶剂，于37 ℃条件下进行水浴15 min，然后于700 nm处测定吸光度值[29]，并按照公式3 计算·OH 的清除率。

式中：Az——空白组在700 nm处的吸光度值。

Ax——样品组在700 nm处的吸光度值。

AY——不加过氧化氢组在700 nm处的吸光度值。

1.2.8 露酒的品评判定标准

依据国家标准GB/T 27588—2011《露酒》、GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》、GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》、GB/T 33406—2016《白酒风味物质阈值测定指南》、GB 2757—2012《食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒》《白酒生产技术全书》（中国轻工业出版社/沈怡方著）、《白酒品酒师手册》（中国轻工业出版社/赖高淮著）等专业文件及书籍制定评分判定表格，由1 名国家白酒评委、3 名省级白酒评委及10 名普通消费者进行盲评打分（其中国家评委评分比重占40%，省级评委评分比重占30 %，普通消费者30 %，总分100分），其复合型露酒感官定量评分表及对应的露酒风味轮见表3和图2。

表2 ·OH体外抗氧化体系测定表(mL)

表3 复合型露酒感官定量评分表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

通过单因素试验分析发现，成品露酒的勾调实验中，品评得分最高分分别出现在糖含量为4.00%到糖含量为8.00 %的区间；酸用量则在0.04 %到0.06 %之间；基酒用量在50.00 %到60.00 %之间（图3）。

2.2 响应面实验结果

响应面实验配方由软件（Design-Expert）自动生成，其配方品评实验结果见表4；响应面实验结果方差分析见表5；响应面各因素对品评实验结果3D效果图见图4、图5、图6。

表4 Box-Behnken Design响应面实验方案及结果

以品评得分为响应值，利用Design-Expert 软件可拟合出3 个影响因素的回归方程为：品评分=84.70+0.45A+1.20B-2.40C+0.10AB-0.90BC-0.75A2-2.95B2-1.35C2。通过Design-expert 软件分析可得出，此方程R=0.928，说明此方程可很好反映3个影响因素对露酒品评分的影响。利用软件分析可得出露酒最佳配方A 为1、B 为0.35、C 为-0.97 水平，即基酒比例为60.00 %，冰糖用量为6.70 %，柠檬酸用量为0.04%。

表5 响应面实验方差分析

以预测的配方组合制备露酒，具体见图7。所得到的复合型露酒颜色橙黄清亮，具有桂花与绞股蓝复合香气且香气舒适、浓郁，口味馥郁，回味具有藤茶特有的甘苦感，综合酒精度在25%vol，典型风格突出的特点。

2.3 抗氧化实验结果

对该成品酒进行体外不同的抗氧化体系（DPPH 体系、ABTS+·体系、·OH 自由基体系）实验，实验结果如图8所示。

通过图8可以发现，3 个体外抗氧化体系均呈现随着成品酒被稀释的倍数越大，酒的体外抗氧化能力（清除率）越低的趋势，其中对于DPPH 自由基体外抗氧化体系，其体外抗氧化能力在样品被稀释100 倍和500 倍时，分别为92.44%和77.00%，但是当样品稀释倍数为1000 倍以上时，样品对DPPH 自由基的体外抗氧化能力在30%以下；针对ABTS 体外抗氧化体系，体外抗氧化能力在样品被稀释1000倍以上时小于50 %，但是同样是样品被稀释1000倍和2000 倍时，ABTS 体系的体外抗氧化能力分别为52.48 %和30.86 %，均高于DPPH 自由基体系的29.75%和15.35%；对于OH 自由基体系而言，样品被稀释倍数大于20 倍时，其体外抗氧化能力为56.52 %，当稀释倍数逐渐增加为100 倍时，体外抗氧化能力为30.89%。

3 小结

通过响应面实验得出最优的复合型露酒的配方：基酒比例为60.00 %，冰糖用量为6.70 %，柠檬酸用量为0.04%（水补足100%），以此配方制备的成品露酒具有酒精度低，易入口、桂花香馥郁，口感回甘等一系列特点。通过对该成品露酒的不同体系体外抗氧化实验，发现该复合型露酒对ABTS+·、DPPH 和·OH 具有较强的清除作用。且有以下几点思考及说明：

（1）该成品酒基于响应面法的配方选定实验中，消费者盲评小组年龄在25～30 岁之间，在口感上均偏向于苦味较小的配方（这一点可以由响应面结果的3D 图直观反映出来），而专业评委则偏向酒度偏高、香味馥郁的配方组，如何建立两者之间的平衡纽带，是我们下一步研究的重点。另限于地理条件，该成品酒没有在更大范围内进行盲评，考虑到酒具有一定的地域性，所以该复合型成品露酒的后续研究将偏向于地域适应性方面。

（2）实验中的原材料，尤其是基于恩施本地的藤茶和绞股蓝，材料本身不仅对人体具有抗氧化、清除自由基的生物活性成分（黄酮、多酚、皂甙、多糖等），而且由于恩施特殊的地理位置（国内唯一探明的独立硒矿床），极有可能还富含富硒的各种大分子物质。诸如硒多糖、硒多肽等，这方面的研究可以作为一个全新的子课题。

（3）对于该复合型成品露酒的体外抗氧化实验中采取了不同的稀释浓度，但是在实际生产中及消费中，该复合型露酒不会再被稀释（即以成品型露酒直接饮用），所以它的体外抗氧化能力应该分别高于90 %（DPPH 体系）、80 %（ABTS+·体系）和86 %（·OH 自由基体系），同时由于该成品露酒暂不定位于保健品及其不可能长期大量饮用的习惯，所以未进行阳性对照试验，同时该成品酒的体外抗氧化能力分别由被浸泡物（桂花、藤茶和绞股蓝）和调味剂（柠檬酸）贡献多少，尚待进一步进行系统研究。

（4）该成品露酒基于恩施地区富硒特性的研究以及以此建立其特征图谱有待于下一步研究，同时该实验中的复合型露酒原酒生产工艺因涉及到专利知识产权，不便公开，敬请谅解。