木聚糖酶xynZF318在枯草芽孢杆菌WB600中的表达及发酵条件优化

田艳杰,宋兆祥,马振武,王朝阳,徐 佳,周晨妍(新乡医学院生命科学技术学院,河南省合成生物学工程实验室,河南新乡 453003)

自然界中的可再生资源来源广泛,含量丰富,种类多样,木聚糖在可再生资源中归属于半纤维素,而半纤维素在可再生资源中仅次于纤维素,位居第二。木聚糖是异质多糖,存在于植物细胞壁中[1-3],其结构复杂,是一种多聚五碳糖,因此利用木聚糖首先需要将其降解为低聚木糖或者小分子的单糖形式,而这些能够降解木聚糖的酶则被称为木聚糖酶。木聚糖酶的种类很多,对木聚糖的降解发挥不同的作用,其中有一种酶能将木聚糖的主链结构降解,这种酶被称为β-1,4-内切-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8][4-6]。目前,木聚糖酶主要被运用于包括工业、农业、食品以及饲料加工等多种领域,但是国内木聚糖酶的产量还不够高,木聚糖酶的价格还比较高昂,因此采用多种手段提高木聚糖酶产量,显得尤为重要[7-9]。

微生物来源的木聚糖酶种类繁多,应用广泛,其主要利用细菌和真菌的发酵生产,因此构建产木聚糖酶工程菌有望使木聚糖酶在工业生产中有更广泛的应用。在构建木聚糖酶工程菌的研究中,大多以大肠杆菌和毕赤酵母为宿主菌,但大肠杆菌和毕赤酵母的次级代谢产物均不能用于食品工业[10]。枯草芽孢杆菌具有生长速度较快,对营养要求较低,对农作物安全,人畜无害,对环境友好等优点,属于食品级安全微生物[11-12],并且枯草芽孢杆菌有完善的分泌系统,可以分泌胞外酶。由于枯草芽孢杆菌的多种优点,近些年,很多研究者将其作为模式生物运用到生物研究中[13-15]。向亚萍等[16]将耐热木聚糖酶基因xynB与质粒载体pXYNB2连接,构建重组载体并将其导入枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组工程菌Bs916/pXYNB2,该工程菌能分泌表达极耐热的木聚糖酶。Gimenez等[17]从Bacillusfirmusstrain 37中克隆得到环糖苷葡聚糖转移酶(CGTase)基因,以pWB980作为载体,将其转化到枯草芽孢杆菌WB800中,获得重组工程菌。Wang等[18]构建新型链霉菌胰蛋白酶GM2938重组质粒,并将其转化枯草芽孢杆菌SCK6,获得GM2938的异源表达。Song等[19]将支链淀粉酶基因PUL在启动子PHpall作用下通过穿梭载体pMA0911在枯草芽孢杆菌WB800中表达。Chen等[20]将从解淀粉芽孢杆菌中获得的α-淀粉酶基因amy1通过载体pP43X异源表达获得WB800重组菌,得到的重组菌比野生菌产α-淀粉酶能力提高1.4倍。通过国内外研究可以看出枯草芽孢杆菌作为宿主菌能够获得表达目的基因的重组工程菌,但是对枯草芽孢杆菌作为宿主菌的研究较大肠杆菌和毕赤酵母少,因此本研究利用枯草芽孢杆菌作为宿主,探索表达木聚糖酶基因的新方法。

本研究利用枯草芽孢杆菌WB600作为宿主菌,以期获得能够稳定产生木聚糖酶的枯草芽孢杆菌重组工程菌。枯草芽孢杆菌作为微生物研究中的模式生物,是一种可以分泌胞外酶的菌株,属于食品级安全微生物,将实验室获得的木聚糖酶基因xynZF-318通过与高表达载体pWB980相连,并将其电击转化到枯草芽孢杆菌WB600中,获得枯草芽孢杆菌重组工程菌,并对其产酶条件进行优化有利于木聚糖酶在工业中的获取与应用。本研究有望为木聚糖酶的工业应用尤其是食品工业应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600、pWB980表达载体 北京天恩泽生物科技有限公司;质粒pET28a-xynZF-318 作者所在实验室前期构建;DNA 质粒小量抽提试剂盒、卡那霉素(Kan)、DNA 胶回收试剂盒 上海生工生物工程有限公司;DNA聚合酶、T4DNA Ligase和限制性内切酶等 TaKaRa公司;DNA Marker MBI公司;蛋白质标椎分子量 索莱宝生物科技有限公司;桦木木聚糖 Sigma 公司;蛋白胨、酵母提取物 赛默飞世尔科技公司;琼脂粉 北京奥博星生物科技有限公司;其余生化试剂 均为国产分析纯产品。

C1000梯度PCR扩增仪 美国Bio-Rad公司;振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;DYY-2稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂;DC-0506fE温恒槽 上海比朗仪器有限公司;HZQ-F160A恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;Neofuge 23R高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PCR引物设计 根据作者所在实验室从黑曲霉中克隆获得的木聚糖酶xynZF-318基因序列(Genbank:JQ700383)及pWB980高表达载体的多克隆位点,设计出两条引物:

xyn318-KCF:5′-CCCAAGCTTTTAATCCCGT CTTCCCCGGCT-3′(HindⅢ酶切位点)

xyn318-KCR:5′-ACGCGTCGACCTACGATAAA GTCCTCC-3′(SalI酶切位点),由金唯智生物公司负责合成。

1.2.2 目的基因xynZF-318表达载体构建 将上下游引物xyn318-KCF和xyn318-KCR以重组质粒pET28a-xynZF-318为模板,进行PCR的扩增。其扩增条件[21]:先预变性,条件为94 ℃,2 min;然后进行变性,条件为94 ℃,30 s;退火,条件为52 ℃,45 s;延伸,条件为72 ℃,1 min;该过程进行35个循环,之后再延伸,条件为72 ℃,10 min。将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳,对目的条带割胶回收,将回收后的产物和pWB980质粒分别用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ,在37 ℃条件下进行双酶切反应,并将双酶切反应后的pWB980表达载体和目的基因分别用胶回收试剂盒进行割胶回收,然后用T4DNA Ligase在16 ℃条件下过夜连接。将连接后的pWB980/xynZF-318转入WB600感受态细胞中,获得转化子,该过程通过电转仪用电击转化的方法进行,电击转化的条件:2.5 ms,1.5 kV。转化子经Kan抗性平板筛选后获得重组菌WB600/pWB980/xynZF-318。(本实验所加Kan抗性的终浓度为100 μg/mL)。

1.2.3 重组木聚糖酶阳性克隆子验证 提取工程菌WB600/pWB980/xynZF-318质粒,并将其作为模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作为上下游引物,对其进行PCR扩增验证。

1.2.4 重组木聚糖酶阳性克隆子筛选 将阳性克隆子接种于LB小试管中,过夜培养,并取少量种子液接种于木聚糖固体平板上,37 ℃培养3～5 d,将其用刚果红溶液染色1 h,用1 mol/L NaOH溶液脱色,观察培养基产生透明圈情况。

1.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳检测 将工程菌WB600/pWB980/xynZF-318种子液转入30 mL/250 mL的LB锥形瓶中进行发酵培养,37 ℃培养6 d后,将酶液收集,5000 r/min离心20 min,取其上清,在-20 ℃冻存后,利用冷冻真空干燥机进行干燥,使上清浓缩至1 mL,浓缩后的蛋白样品通过SDS-PAGE电泳后,用考马斯R-250染色,脱色后检测目标蛋白的表达情况。

1.2.6 木聚糖酶活力测定 采用DNS法,即3,5-dinitrosalicylic acid测定木聚糖酶活力[22]。以1 min产生1 μmol的还原性木糖所需要的酶量作为一个酶活力单位,即U/ml。

1.2.7 重组木聚糖酶摇瓶发酵工艺优化 对枯草芽孢杆菌重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318进行摇瓶发酵工艺优化。以培养温度37 ℃、接种量1%、装液量30 mL、种龄10 h、转速220 r/min、发酵时间120 h为基础培养条件,首先采用单因素的方法优化重组菌产酶条件。依次对菌种的接种量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、250 mL锥形瓶的装液量(25、30、40、50、60、70 mL)、菌种的种龄(10、12、14、16、18 h)、培养温度(30、32、35、37、39 ℃)、摇床转速(120、140、160、180 r/min)以及发酵时间(48、72、96、120、144、168、192 h)进行优化,每次均以获取的最佳条件作为定量值,以所要优化的单因素条件作为变量,获得单因素优化的最适条件。

在单因素优化最佳结果的基础上,以接种量(%)、装液量(mL)和种龄(h)为自变量,以酶活力(U/mL)为响应值,对枯草芽孢杆菌重组工程菌进行响应面实验[23-24],确定其摇瓶的最优发酵工艺条件。

表1 实验因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3 数据处理

每个实验设计3个重复实验,使用Design Expert 8.0软件设计影响酶活力表达量的各项组合实验。

2 结果与分析

2.1 重组工程菌的构建

按1.2.2方法PCR扩增的目的条带位置如图1所示。然后将其割胶回收,与高表达载体pWB980一起双酶切,条带如图2所示。酶切产物连接液经电转仪电击转化进枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞,用含有Kan抗性平板筛选转化子,获得枯草芽孢杆菌重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。

图1 基因xynZF-318的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR扩增得到的xynZF-318。

图2 pWB980质粒与xynZF-318基因双酶切Fig.2 Double digestion of pWB980 vector and xynZF-318注：M：DNA Marker； 1、2、3：质粒pWB980；4、5：基因xynZF-318片段。

2.2 重组工程菌基因表达验证

重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318质粒提取如图3所示。以从工程菌中提取的质粒为模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作为上下游引物,经PCR扩增获得条带如图4所示。图3、图4说明重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318基因构建成功。

图3 重组质粒提取Fig.3 Extraction of the recombinant plasmid注：1：pWB980质粒；2：pWB980/xynZF-318。

图4 基因xynZF-318的PCR扩增验证Fig.4 PCR validation of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR扩增得到的xynZF-318。

2.3 重组工程菌阳性克隆子筛选

重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318经木聚糖固体培养基上培养3～5 d之后,用刚果红溶液染色,由图5可知,WB600/pWB980/xynZF-318菌落经刚果红染色时,出现明显透明圈,而同步培养的WB600菌落则没有出现,说明该重组工程菌能产生木聚糖酶。

图5 刚果红染色筛选重组工程菌Fig.5 Congo red staining for screening recombinant engineering bacteria注：1：WB600/pWB980/xynZF-318菌落；2：WB600菌落。

2.4 SDS-PAGE凝胶电泳检测

通过SDS-PAGE凝胶电泳图片观察XynZF-318目的基因条带,由图6可知,在33 kDa处有明显的条带,该条带位置与XynZF-318的蛋白分子质量相同[25]。

图6 重组XynZF-318的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of XynZF-318注：M: Pageruler prestained protein ladder；1:WB600蛋白条带；2:WB600/xynZF-318条带。

2.5 重组菌木聚糖酶活力测定

由表2可知,本研究成功获得产木聚糖酶枯草芽孢杆菌重组工程菌,重组菌粗酶液酶活力较野生菌WB600提高了1.91倍。粗酶液测定时重组菌WB600/pWB980/xynZF-318的颜色比WB600 粗酶液的颜色明显加深,说明重组菌的木聚糖酶表达较好。

表2 重组菌酶活测定Table 2 Enzyme activity determination of recombinant bacteria

2.6 重组菌WB600/pWB980/xynZF-318摇瓶发酵工艺研究

2.6.1 单因素实验结果 对重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318进行单因素发酵条件优化,获得最适条件如图7所示。图7a所示,接种量为1.5%时相对酶活力最高,当接种量小于1.5%时,重组菌的相对酶活力仅为最高酶活力的40%,当接种量大于1.5%时,相对酶活力呈递减趋势。图7b所示,装液量为30 mL时相对酶活力最高,随着装液量的逐渐增加,菌体的溶氧量逐渐减少,因此产酶活力呈下降趋势。图7c所示,种龄为12 h 时相对酶活力最高,当种龄小于12 h时相对酶活力增加较快,当种龄大于12 h时,其相对酶活力逐渐减少但减少幅度较小,说明种龄增加对重组菌产酶活力影响较小。图7d所示,培养温度为37 ℃时,相对酶活力最高,当温度低于37 ℃时,重组菌的相对酶活力较低,说明温度低于37 ℃时重组菌几乎没有酶活力。图7e所示,转速为160 r/min时相对酶活力最高,当转速小于或大于160 r/min时,相对酶活力均下降,但总体下降趋势较小,说明转速对重组菌产酶影响不大。图7f所示,最佳发酵时间为168 h,随着发酵时间的延长,重组菌酶活力逐渐增加,当发酵时间为168 h时酶活力达到最大。

图7 单因素实验结果Fig.7 Single factors experiments results

2.6.2 响应面实验结果分析 在前期单因素实验基础上,根据摇瓶发酵单因素优化实验可以确定,重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318的最佳的摇瓶发酵条件为:接种量1.5%;装液量30 mL;种龄12 h;转速160 r/min;培养温度37 ℃;发酵时间168 h。根据单因素数据分析,培养温度较低时重组菌几乎没有酶活力,而转速对酶活力的影响较小,本研究以接种量、装液量、种龄为自变量设计响应面实验因素水平表,进行响应面实验操作,以木聚糖酶活力作为该实验因变量,对该工程菌进行测定,如表3所示。运用Design Expert 8.0进行分析,如图8所示,对该实验结果进行统计学分析,通过最小二乘法回归方程式分析得到枯草芽孢杆菌重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318产木聚糖酶活力R与接种量A、装液量B、种龄C的二次多项回归模型:酶活力(R)=0.24-0.01A-0.091B-0.01C+0.007AB+0.01AC+0.007BC-0.018A2+0.045B2-0.006C2。对该回归方程进行方差分析,由表4可知,模型的P<0.01,说明该实验模型极显著;失拟项不显著(P=0.1262>0.05),决定系数R2=96.02%,说明该回归方程的拟合度良好,该模型成立。方程的一次项中B(P<0.0001)极显著,说明装液量对工程菌产酶活力影响极显著,根据F值大小可以判断本实验所采用的3个因素对工程菌产酶活力影响的主次顺序为B(装液量)>A(接种量)>C(种龄);二次项B2极显著(P<0.01)。

表3 响应面分析试验结果Table 3 Experimental results of response surface analysis

图8 两因素交互作用对响应值影响的响应面图Fig.8 Response surface diagram of the inflnence of the interaction of two factors on the response value

表4 响应面模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface model

由图8可知,A、B、C三个影响因素对酶活力的影响均不同,根据二次多项回归方程、单因素优化结果可以得出预测最优水平:接种量:1.23%、装液量:20.05 mL、种龄:10.93 h培养温度为37 ℃、摇床转速为160 r/min、发酵时间为168 h,在此条件下重组菌酶活力预测值可达0.382 U/mL,由于实际操作可行性选取最优的发酵条件为:接种量为1.2%、装液量为20 mL、种龄为11 h、培养温度为37 ℃、摇床转速为160 r/min、发酵时间为168 h。经重复实验验证后,得到实际酶活力为0.359 U/mL,比预测值(0.382 U/mL)小6.0%,说明此回归方程较好地反应了实际情况。但是本研究与向亚萍等[16]研究相比也存在表达过程中质粒拷贝数较低,以及酶稳定性较差等问题,针对现存的问题,作者后续将积极寻找解决方案。

3 结论

本研究构建枯草芽孢杆菌重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318,该工程菌能有效产生木聚糖酶。由单因素和响应面结果分析最优的发酵条件为:接种量1.2%、装液量20 mL、种龄11 h、培养温度37 ℃、摇床转速160 r/min、发酵时间168 h。经重复实验验证后,得到实际酶活力为0.359 U/mL。本研究成功获得产木聚糖酶枯草芽孢杆菌重组工程菌,菌株的产酶活力较野生菌WB600(0.098 U/mL)提高了2.66倍。

本研究成功获得产木聚糖酶枯草芽孢杆菌重组工程菌,菌株的产酶活力较野生菌有明显提高,并且枯草芽孢杆菌能直接将木聚糖酶分泌到胞外,有利于木聚糖酶的分离与提取,为木聚糖酶在枯草芽孢杆菌宿主菌中获得表达提供思路,有望为木聚糖酶的工业应用尤其是食品工业应用拓宽道路。