靶向沉默黑色素瘤细胞Pim-1 基因对其凋亡蛋白表达的影响

崔自重

( 长沙市第三医院 湖南 长沙 410015)

黑色素瘤是起源于皮肤黑素细胞的常见皮肤肿瘤，具有恶性程度高、转移快、预后差等特点。随着该疾病在我国的发病率急速增加，病死率也呈现一定的上升趋势[1]。黑色素瘤放化疗疗效欠佳，多以手术切除为主。但单纯手术也不能很好提升患者的生存期，分子生物学技术是今后肿瘤治疗的主要方向。肿瘤的生物治疗通过RNA 干扰或特异性沉默肿瘤诱发基因来影响肿瘤细胞与外基质的黏附，从而抑制肿瘤生长[2]。Pim-1 是一种保守的丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶基因，主要通过磷酸化途径使底物特异性的失活，从而促进癌细胞的增殖。已有研究发现，Pim-1 在黑色素瘤患者体内表达非常活跃，表明该基因对B16 细胞的生物学行为具有一定影响。

1.材料与方法

1.1 细胞与试剂

2019 年3 月—10 月期间进行实验研究。人黑色素瘤细胞（B16）由长沙医学院新型药物制剂研发湖南省重点实验室培育基地（平台编号2016TP1029）提供；新生牛血清购于济南劲牛生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒和细胞总蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物试剂公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购自于国药集团化学试剂有限公司；Pim-1 抗体（1:1000）、Bax（1:1000）抗体、Bad（1:1000）抗体均购于Abcam 公司（中国）。

1.2 分组方法

取人黑色素瘤细胞，根据是否沉默Pim-1 基因分为对照组和试验组。对照组（B16 细胞）：取B16 细胞用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培养液（含浓度100μ/mL 青霉素、链霉素。pH=7.2 ～7.4）在37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养和传代。试验组（转染B16 后沉默Pim-1 基因）：同样用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培养液进行培养，培养条件同对照组。待细胞完全贴壁后，吸出各孔培养液，加入100μL不含牛血清的培养基，再加入Pim-1 基因。感染时间为90min，每15min 轻微晃动培养液一次。90min 后吸出无血清的培养液，置于37℃、5.0% CO2的饱和湿度培养箱中培养和传代[3-4]。

1.3 数据采集

（1）细胞增殖指数：将B16 细胞按照8000/孔的密度接于22 孔培养板中，每孔5 组，置于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养和传代，试验组培养5h 后转染Pim-1 质粒，分别在12h、24h 以及48h 加入MTT（5mg/mL）20ml，继续培养4h，吸出培养上清液，每孔中加入200mL DMSO，待结晶溶解后测定570nm处的光密度（D）值，按下列公式计算两组细胞的增殖指数：增殖率（%）=试验组D 值/对照组（0h）D 值×100%，实验重复3次[5]。细胞凋亡率：采用Annexin V/PI 染色法测凋亡率。取两组细胞制成单细胞悬液（细胞密度为1×107个/mL），用PBS 清洗两次，加入相应比例（1：1000）的Annexin V 抗体避光染色10min，然后加入适量PBS 溶液和PI 染液混匀，流式细胞仪检测Annexin V 阳性细胞比例，即为细胞凋亡率[6]。

（2）细胞Bcl-2 蛋白质、Bax 蛋白质、Bad 蛋白质的表达量：该三种蛋白质含量检测均采用Weatern blomng 法检测，一抗分别为Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、Bad（1:1000），二抗为辣根过氧化物酶耦合联二扰（1:1000）。

1.4 统计学方法

统计学处理数据应用SPSS20.0 统计软件进行分析。两组细胞增殖指数、凋亡率、Bcl-2、Bax、Bad 蛋白质含量均采用（±s）描述，组间比较采用两独立样本t检验，三个时间点比较采用F 检验，而后采用SNK-q 法进行两两比较。同一指标三个时间点比较用重复测量方差分析判定差异具体来源（组间、时间、交互）。通过拟合二分类Logistic 回归方程综合分析3 种蛋白表达水平对沉默黑色素瘤细胞Pim-1 基因沉默情况的综合影响。P＜0.001 为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 两组细胞增殖指数的比较

时间越久，各组细胞的增殖指数显著下降（P＜0.001）。三个时间点比较，试验组细胞的增殖指数显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。重复测量F 分析，组间因素（F=113.718，P＜0.001）和时间因素（F=30.045，P＜0.001）对细胞增殖指数的影响有统计学意义，交互因素（F=0.180，P＞0.05）对细胞增殖指数的影响无统计学意义。见表1。

表1 两组细胞增殖指数的比较（±s）

表1 两组细胞增殖指数的比较（±s）

注：与24h 比较 a P ＜0.001；与48h 组比较 b P ＜0.001。

组别 n 24h 48h 96h F P试验组 110 9.15±1.67 4.08±1.14a 1.67±0.35ab 1176.590 ＜0.001对照组 110 13.25±1.95 5.24±1.46a 1.94±0.32ab 1881.185 ＜0.001 t - 280.532 43.138 35.656 - -P - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.2 两组细胞凋亡率的比较

时间越久，各组细胞的凋亡率显著升高（P＜0.001）。三个时间点比较，试验组细胞的凋亡率显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。重复测量F分析，组间因素（F=150.559，P＜0.001）和时间因素（F=107.547，P＜0.001）对细胞凋亡率的影响有统计学意义，交互因素（F=5.592，P＞0.05）对细胞增殖指数的影响无统计学意义，见表2。

表2 两组细胞凋亡率的比较（±s）

表2 两组细胞凋亡率的比较（±s）

注：与24h 比较 aP ＜0.001；与48h 组比较bP ＜0.001。

组别 n 24h 48h 96h F P试验组 110 1.27±0.53 2.82±0.64a 4.06±0.82ab 933.861 ＜0.001对照组 110 1.11±0.46 1.34±0.58a 1.87±0.60ab 91.473 ＜0.001 t - 3.775 322.981 511.014 - -P - 0.053 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.3 两组细胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表达含量的比较

试验组细胞的Bcl-2 蛋白质表达量显著低于对照组（P＜0.001），试验组细胞的Bax、Bad 蛋白质表达量显著高于对照组（P＜0.001），见表3。

表3 两组细胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表达含量的比较（±s）

表3 两组细胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表达含量的比较（±s）

组别 n Bcl-2 蛋白 Bax 蛋白 Bad 蛋白试验组 110 1.14±0.31 0.95±0.28 1.18±0.34对照组 110 2.11±0.45 0.66±0.17 0.77±0.13 t-346.614 86.216 139.555 P-＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量检测对B16 细胞Pim-1 基因沉默情况的综合影响

3 种蛋白和B16 细胞Pim-1 基因沉默情况拟合的回归方程有统计学意义（χ2=106.110，P ＜0.001）。3 种蛋白对Pim-1 基因沉默情况综合影响依次为：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白，见表4。

表4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量检测对B16 细胞Pim-1 基因沉默情况的综合影响

3.讨论

黑色素瘤具有显著的早期转移特点，因此手术切除对该肿瘤大部分患者的临床治疗具有极大局限性。生物治疗作为一种“绿色疗法”，可以靶向性的凋亡肿瘤细胞而调控肿瘤生长。Pim-1 是Pim 家族之一，Pim-1、Pim-2、Pim-3 氨基酸系列具有高度同源性。Pim-1 因能发挥多种生物学功能而被广泛研究，诸多学者认为其能加速凋亡蛋白Bad 磷酸化而抑制肿瘤细胞发生凋亡，原癌基因Pim-1 在前列腺癌、肝癌、胃癌等多种癌症中均有高水平表达，因此，靶向调控B16 细胞中Pim-1 活性可能有助于改善黑色素瘤患者预后。

本文发现，向黑色素瘤B16 细胞中转染Pim-1 质粒能显著抑制黑色素瘤细胞B16的表达，该结果与Konrad P研究基本一致。进一步进行组间比较分析发现，沉默Pim-1 基因能明显增强黑色素瘤细胞B16 的凋亡能力。出现这一结果主要可能与Pim-1 的磷酸化作用有关，磷酸酶Cdc25A 是一个正性特异性G1 期调节子，它能使cyclin-CDK 复合物中细胞周期素依赖性激酶上的15 位酪氨酸残基去磷酸化，使cyclin-CDK 复合物活化，促使细胞周期由G1 期向S 期转化。Pim-1 蛋白具有高保真性和自身组成性激活突变型，其产物Pim-1 激酶是一个被称为ATP 锚的活化位点，它的催化结构域覆盖了从38-290 位的氨基酸区域，这个区域中44-52 位和67 位氨基酸为磷酸盐结合位点，Pim-1 基因一方面通过磷酸化Cdc25A，增强它的磷酸酶活性，导致细胞凋亡减少、增殖增多，加速细胞周期G2/M 期的进程，最终调控肿瘤的发生和发展。另一方面，可以通过调节Runt 相关转录因子的活性来实现Th 细胞分化的调节，Runx 基因家族包括Runx1、Runx2、Runx3 三个成员，是一种转录因子家族，通过合成DNA 结合蛋白，从而在细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。Pim-1 和Runx 家族转录因子共同定位在细胞核内，增加Runx 蛋白的转录活性，因而导致黑色素瘤细胞B16 的增殖受到抑制[7-8]。

同时，试验组细胞的Bcl-2 表达量显著低于对照组，试验组细胞的Bax、Bad 表达量显著高于对照组。Bcl-2 家族是一组通过影响线粒体外膜上通透性转换通道的稳定性来调控细胞凋亡的蛋白质，包括抑制凋亡基因与促进凋亡基因两大类，抑制凋亡基因主要有Bcl-2、Bcl-xL 等，通过增加PT 通道的开放来促进细胞凋亡的基因主要有Bax、Bad 等。骆曼[9]指出，靶控Fascin-1 对恶性黑色素瘤细胞亦会产生类似效果，两个基因是否同效需要后续验证。Bcl-2 存在于线粒体上，对线粒体膜具有调节功能，线粒体膜通透性转换孔与Bcl-2 和Bax 之间关系紧密，细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白激酶caspase 级联反应的结果，由线粒体膜的通透性转化孔开放直接导致[10]。同时，沉默Pim-1 基因转染的B16 可以通过抑制Bcl-2 蛋白表达，来促进Bad、Bax 等凋亡分子表达而发挥促凋亡的作用。这说明沉默Pim-2 基因对黑色素瘤细胞B16 的凋亡和增殖影响与其调控Bcl-2 家族相关基因的表达有关[11]。Pim-1 激酶能够直接磷酸化促凋亡BH3-only 蛋白Bad 上112 位丝氨酸，这是Bad 蛋白的一个失活性守门人位点，Pim-1 激酶通过抑制Bad 蛋白从而间接提高Bcl-2 的活性，稳定线粒体外膜抑制线粒体凋亡蛋白的释放，促使细胞因子撤出下的存活。还有研究指出，靶向沉默Pim-1 基因会影响Stat3 的泛素化和降解过程，因此Pim-1 激酶对Bad 蛋白的影响可能存在其他间接途径，后续研究需要进一步探究。研究还发现，靶向沉默黑色素瘤细胞Pim-1 基因沉默后，主要特征蛋白表达影响从高到低依次为：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白。可间接反推，Bcl-2 蛋白精准、定量检测对黑色素瘤快速筛查可能有一定应用价值。

细胞实验初步证实了靶向沉默Pim-1 基因对黑色素瘤细胞发生凋亡的短期影响，但是本文亦有一定局限性，受限于时间和经费，纳入观察的细胞株及观测时间均相对较短。同时，靶向沉默Pim-1 基因在活体动物实验中将产生何种具体效果，对不同肿瘤细胞增殖情况是否均有等效的抑制效果仍有待观察。