超声波辅助热加工泡椒猪肝中优势腐败菌的分离鉴定及抑菌试验

任政伟，王艺华，刘春燕，丁捷*，刘浩宇，陈美玲

(1.四川旅游学院 食品学院，成都 610100；2.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316000)

泡椒猪肝营养丰富，属于低温加工肉制品，且泡椒类产品深受群众喜爱。近年来，许多研究人员对泡椒猪肝的加工工艺进行了大量的研究[1]。林坤等[2]对腊猪肝类休闲食品的加工技术进行了研究；卢雪松等[3]优化了泡椒猪肝的生产工艺；崔瑞颖等[4]采用添加剂影响猪肝酱品质。戚彪等[5]的研究表明微波杀菌与高温杀菌相比较，品质变化较小。Hanieh等[6]在研究中发现超声波结合水蒸气的处理方法，其菌落总数可以减少3个对数级。Smith等[7]在研究中发现，高强度超声和抗菌剂的结合使用可以使病原菌的杀灭效果更好。Morild等[8]在研究中发现，在持续高功率超声结合处理后，猪皮和肉表面的病原菌明显减少。随着生活质量的提高，人们对泡椒类产品的需求增大，而改善产品的风味品质已经迫在眉睫[9-11]。

课题组前期将超声波热处理应用于真空低温烹饪领域获得了良好的研究成果，尤其针对猪肝、凤爪等经过多次热处理、极易造成其质构特性等感官状态下降的原料，有效改良了其成品的质构特性[12,13]。在超声波低温真空技术加工肉制品的过程中，超声波可同时起到杀菌和进一步熟化的作用，但杀菌效果有限，无法完全杀死产品中耐热的芽孢菌。因此，分离鉴定超声波热处理肉制品中腐败菌，同时进行天然成分的抑菌试验，对进一步延长该技术处理后肉制品的保质期具有重要意义。目前，该类型研究报道尚属空白领域。本试验通过从超声波低温真空技术加工泡椒猪肝中，分离筛选获得优势腐败菌，并对其进行形态学和分子生物学的鉴定，确定种类，并建立生长曲线，进行天然抑菌物质的筛选，为延长超声波辅助真空低温烹饪产品的保质期提供了理论依据，为后续复配天然抑菌剂的研发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肝、泡椒：购于成都市龙泉驿区平安菜市场；培养基配方药品：北京奥博星生物科技有限公司；可溶性淀粉：成都市科隆化工试剂厂；蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸石炭酸棉蓝染液、酪蛋白、酪氨酸、结晶紫：天津市致远化学试剂有限公司；茶多酚、醋酸、柠檬酸、乳酸：均为分析纯，由成都鹏世达实验用品有限公司提供；过氧化氢、95%乙醇：国药集团化学试剂有限公司。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHP0201147047型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-IF型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；BH200型微生物显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；YX-280A型立式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；QYC-2102C型摇床 上海福玛实验设备有限公司；202-3AB型电热恒温干燥箱 余姚市东方电工仪器厂；S-3C型pH计 成都世纪方舟科技有限公司；S1000型PCR扩增仪、Gel-Doc-200型凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司；DY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；牛津杯(外径 8 mm，内径6 mm，高 10 mm) 上海申贤恒温设备厂；LRH-280 型生化培养箱 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

新鲜猪肝→切片(切成约0.3 cm×0.5 cm×0.2 cm厚的柳叶)→流水冲洗(1 h)→焯水(姜10 g，葱20 g，料酒40 g，盐1 g，100 ℃，20 min)→腌制液浸泡(12 h)→晾干→分装(150 g/袋)→真空包装→超声波加热处理→冷却→成品。

1.3.2 菌株分离

将成品猪肝置于37 ℃恒温培养箱中贮藏，培养72 h后称取25 g样品放在225 mL无菌生理盐水的无菌均质杯内，80000 r/min 均质2 min。用无菌吸管吸取1 mL菌液于9 mL无菌蒸馏水中，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度大小的菌悬液。再分别吸取0.1 mL不同稀释浓度下的菌悬液于营养琼脂培养基上进行涂布，用于菌种的分离，在37 ℃下培养48 h后，挑选菌落形态大小不同的微生物进行纯化培养。

1.3.3 优势腐败菌的鉴定

1.3.3.1 菌落及形态特征观察

在无菌操作的条件下，将优势腐败菌接种在营养琼脂培养基上，进行涂布，37 ℃培养48 h，观察菌落大小、形态、颜色等并做好记录。

再对菌落按照革兰氏染色的方法对菌株进行染色，判断其为革兰氏阳性菌还是阴性菌，并观察单个菌种的形态。严谨观察、描述、拍照、记录。

1.3.3.2 生理生化试验

对分离出的主要腐败菌根据其特性进行了糖发酵、V.P、甲基红、酶促、吲哚、明胶液化等生理生化试验对菌株进行鉴定。

1.3.3.3 16S rDNA菌种鉴定

将所得菌株送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。所得序列利用Blast程序，将所测定菌株的16S rDNA序列同GenBank中已提交的序列进行Blast N分析和同源比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，进一步确定菌株的种属性质。

1.3.4 抑菌试验

1.3.4.1 供试菌种菌悬液的制备及培养

用高温灭菌并冷却的接种环从斜面培养基上分别刮少量活化的菌种，分别接种在不同的液体培养基中，在摇床中培养48 h 后，置于4 ℃恒温箱中备用。

1.3.4.2 抑菌剂浓度试验

通过固体平板扩散法，分别考察乳酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、柠檬酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、醋酸溶液(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、茶多酚溶液(1%、2%、3%、4%、5%)对超声波辅助热处理猪肝中优势腐败菌的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 优势腐败菌的分离筛选

通过分离纯化，获得优势腐败菌7种，分别将其编号为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。进行革兰氏染色后，将微生物置于显微镜的油镜下观察。

2.2 优势腐败菌的鉴定

对分离出的7种腐败菌的菌落形态进行观察鉴定，其形态特征见表1。

表1 主要腐败菌的形态描述

2.3 生理生化和形态特征

对分离出的主要腐败菌进行生理生化试验，对菌株进行鉴定，其结果见表2。

表2 主要腐败菌的生理生化试验结果

2.4 分子鉴定结果及优势腐败菌分析

对7种腐败菌进行16S rDNA鉴定，并绘制生长树，其结果见图1。

图1 主要腐败菌发育树构建

根据试验步骤，筛选得到7种主要腐败菌，并得到各个菌种的16S rDNA序列。将各个菌种的16S rDNA序列在CNBI基因库中进行同源性比较，获得与菌种序列相似度最高的菌株，即初步认定该菌株种类。从中选取若干个相似性高的菌株序列，使用软件，通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

7种腐败菌的测序结果见表3。

表3 主要腐败菌的测序结果

结合图1和表3不难发现X4、X5与Bacillussubtilis同源性最高，X1与Paenibacilluspolymyxa同源性最高，X2与Pseudomonasfragi同源性最高，X6与Bacillussp.同源性最高。泡椒猪肝是低温加工肉制品，低温热处理对芽孢杆菌属这种稳定性好、耐氧化、耐挤压、耐高温的微生物较难完全杀灭，因此在后期的贮藏及运输过程中，一旦条件适宜或者受到污染，就会迅速生长繁殖，造成食品的腐败变质[14]。莓实假单胞菌属于假单胞菌属，因其更适应低温环境，所以在泡椒猪肝加工过程中极易繁殖，是低温加工肉制品的典型腐败菌。高磊等[15]研究发现假单胞菌是冷鲜鸡腿肉中的优势腐败菌。Wang Guangyu等[16]发现，在有氧冷藏条件下的黄羽鸡肉中，假单胞菌属是优势腐败菌，莓实假单胞菌对其具有较强的致腐能力。很多研究文献表明，芽孢杆菌和假单胞菌是肉制品中的主要腐败菌[17-19]。

2.5 固体平板扩散法试验结果

2.5.1 不同浓度乳酸抑菌液对几种腐败菌的抑制效果

浓度为1%～5%的乳酸对5种腐败菌的抑制效果见表4。

表4 不同浓度乳酸抑菌液对5种腐败菌的抑制效果

由表4可知，乳酸对这5种腐败菌均有一定的抑制作用，5种腐败菌伴随着乳酸抑菌剂浓度的增加，所对应的抑菌圈均呈现由小变大的趋势。对于X1，浓度为5%时抑菌圈大小约为1%浓度的1.5倍；对于X2，浓度为5%时抑菌圈大小约为1%浓度的1.93倍；对于X4，浓度为5%时抑菌圈大小约为1%浓度的1.5倍；对于X5，浓度为5%时抑菌圈大小约为1%浓度的1.7倍；对于X6，浓度为5%时抑菌圈大小约为1%浓度的1.9倍。根据抑菌圈平均值大小可以初步判断其对5种腐败菌的抑制效果都比较强。

2.5.2 不同浓度柠檬酸抑菌液对几种腐败菌的抑制效果

浓度为1%～5%的柠檬酸对5种腐败菌的抑制效果见表5。

表5 不同浓度柠檬酸抑菌液对5种腐败菌的抑制效果

由表5可知，柠檬酸对这5种腐败菌都有一定的抑制作用，但效果不佳，且浓度较低时无法起到抑菌作用，尤其是在浓度为1%和2%时根本无法测量其抑菌圈大小，浓度提高后虽能测量出来抑菌圈大小，但效果依然不明显。

2.5.3 不同浓度醋酸抑菌液对几种腐败菌的抑制效果

浓度为0.5%～2.5%的醋酸对5种腐败菌的抑制效果见表6。

表6 不同浓度醋酸抑菌液对5种腐败菌的抑制效果

由表6可知，醋酸对这5种腐败菌都有十分强的抑制作用，在浓度较低时也可以看到明显的抑菌圈。5种腐败菌随着醋酸浓度的增加，所对应的抑菌圈均呈现逐渐增大的趋势。对于X1，浓度为2.5%时抑菌圈大小约为0.5%浓度的1.3倍；对于X2，浓度为2.5%时抑菌圈大小约为0.5%浓度的3.4倍；对于X4，浓度为2.5%时抑菌圈大小约为0.5%浓度的1.9倍；对于X5，浓度为2.5%时抑菌圈大小约为0.5%浓度的1.7倍；对于X6，浓度2.5%时抑菌圈大小约为0.5%浓度的1.7倍。根据抑菌圈平均值大小可以初步判断其对5种腐败菌的抑制效果都比较强。

2.5.4 不同浓度茶多酚抑菌液对几种腐败菌的抑制效果

浓度为1%～5%的茶多酚对5种腐败菌的抑制效果见表7。

表7 不同浓度茶多酚抑菌液对5种腐败菌的抑制效果

由表7可知，低浓度的茶多酚溶液对多粘类芽孢杆菌和两种枯草芽孢杆菌的抑制作用均不明显，甚至在浓度低时几乎无抑制作用；因为茶多酚溶液颜色较深，抑菌圈不易观察，因此在测量抑菌圈大小时容易造成误差。

3 结论

本试验采用十倍稀释涂布法，筛选超声波低温真空技术加工的泡椒猪肝中的主要腐败菌，对其进行菌落、显微镜形态观察以及16S rDNA片段扩增和序列分析技术，最终确定多粘类芽孢杆菌(X1)、莓实假单胞菌(X2)、3种枯草芽孢杆菌(X4、X5、X6)5种优势腐败菌；通过平板扩散法研究乳酸、醋酸、柠檬酸和茶多酚对5种优势腐败菌的抑菌效果，其中乳酸、醋酸这两种抑菌剂对这5种腐败菌均有较好的抑菌效果，且能明显观察并测量出抑菌圈大小；综合分析确定乳酸、醋酸对5株腐败菌的最低抑制浓度分别为2.0%、2.0%。

本次试验所测数据将为后面复配抑菌剂提供理论依据，为接下来复配抑菌剂的研究奠定基础，筛选出能使泡椒猪肝贮藏更长时间的复配抑菌剂。在后续试验中添加使泡椒猪肝贮藏时间更长，有效延长泡椒猪肝的保质期。