一株鸭源巴氏杆菌的分离及荚膜抗原血清型鉴定

2020-11-27 13:34贾仰波
中国动物保健 2020年2期
关键词:血清型氏杆菌霉素

贾仰波

(山东省博兴县畜牧兽医局山东滨州 256500)

鸭巴氏杆菌病又称鸭霍乱,是由禽多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病,该病主要引起禽类出血性败血症,发病急、死亡快。多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可以分为A、B、D、E、F 等5 种血清型,且不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护力,通常我国家禽中主要流行A 型多杀性巴氏杆菌。2018 年5 月某鸭场270 日龄的产蛋鸭突然出现大规模死亡情况,未死病鸭多精神沉郁、呼吸困难、食欲废绝、排黄绿色稀粪,急性病死鸭没有明显的临床症状,发病率约21%,死亡率高达40%。对病死鸭进行剖检有明显的败血症症状,肝脏肿大、质脆,表面有大量针尖大小的灰白色坏死点,心包膜增厚、有积液,各段肠黏膜弥漫性出血,脾脏肿大出血等。本文从这例典型的鸭巴氏杆菌病中分离一株鸭源荚膜血清型为A 型的巴氏杆菌并对其进行鉴定,可为临床诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源病死鸭来自山东某鸭场,无菌采集心脏、肝脏作为病料。

1.1.2 培养基及试剂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、新生牛血清等,均购自武汉洁洋盛科技有限公司;革兰氏染色试剂,购自北京索莱宝科技有限公司产品;药敏纸片和微量生化试管,购自杭州微生物试剂有限公司;2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker 均购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 PCR 引物根据禽多杀性巴氏杆菌特异基因设计PCR 引物。鉴定引物序列如下,P1:5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3',P2:5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3',目的片段为457bp;荚膜血清型A、B、D、E、F 特异性基因引物序列如下,A1:5'-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3',A2:5'-TTGCCATCATTGTCAGTG-3',目的片段为1044bp;B1:5'-CATTTATCCAAGCTCCACC-3',B2:5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3',目的片段为760bp;D1:5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3',D2:5'-CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3',目的片段为657bp;E1:5'-TCCGCAGAAAATTATTGACTC-3',E2:5'-GCTTGCTCTTGATTTTG TC-3',目的片段为 511bp;F1:5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3',F2:5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3',目的片段为851bp。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离无菌环境下将采集的心脏、肝脏等病料接种到2%新生牛血清胰酪大豆胨琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基平板上,37℃恒温培养24h,观察菌落形态,挑取典型单菌落进行革兰氏染色、镜检,同时划线接种于含2%新生牛血清TSA 平板纯化培养。

1.2.2 生化试验按常规方法进行生化试验,将纯化的病原菌分别接种于各微量生化发酵管内,37℃培养24~48h,观察反应结果。

1.2.3 PCR 鉴定 将纯化分离菌煮沸10min,10,000rpm 离心5min,取上清液作为PCR 模板;鉴定PCR 体系为:2× Taq PCR Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL,补ddH2O 至20μL,同时设立阴阳性对照,阳性对照选用标准株C48-2 株(CVCC44802);反应条件为95℃预变性5min,95℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸40s,30 个循环,最后72℃延伸10min;分型使用多重PCR 方法,反应体系和条件与鉴定PCR 一致。PCR 反应结束后用1%的琼脂糖凝胶板电泳,并用凝胶成像仪进行成像分析。

1.2.4 药敏试验采用纸片扩散(K-B)法进行分离菌的药敏试验。选用15 种药敏纸片:大观霉素、诺氟沙星、头孢曲松、四环素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、多黏菌素B、磺胺异噁唑、多西环素,37℃培养24h后观察测量抑菌圈的直径,按照抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)进行敏感性分析。

2 结果

2.1 细菌分离

在2%新生牛血清胰酪大豆胨琼脂培养基上可见有圆形、灰白色、边缘整齐、湿润似露珠样的大小不一菌落,革兰氏染色镜检为革兰氏阴性短杆菌;而在麦康凯平板上无菌生长。

2.2 生化试验

生化鉴定结果显示该分离株能够发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇,不发酵麦芽糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖,脲酶试验、甲基红和V-P 试验阴性,接触酶试验、吲哚试验为阳性,与多杀性巴氏杆菌的生化特征相似。

2.3 PCR 鉴定

鉴定PCR 产物在457bp 处得到预期的目的条带。A、B、D、E、F 荚膜血清型分型PCR 检测只扩增出了大小约1000bp 的目的条带,与荚膜血清A 型特异性基因预期大小一致。由此根据临床症状、剖检变化、菌株的形态特征、生化特性及PCR 鉴定分型结果,确定该分离株为鸭源荚膜血清A 型多杀性巴氏杆菌。

2.4 药敏试验

药敏结果表明该分离菌呈多重耐药,对大观霉素、多黏菌素B中度敏感,对头孢曲松低敏,对诺氟沙星、四环素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、磺胺异噁唑、多西环素耐药。

3 讨论

鸭巴氏杆菌病是当前严重危害养鸭业的重要细菌性传染病之一,急性型发病率和死亡率可高达80%~90%,尤其产蛋鸭更易感染发病。经了解该养殖场没有及时免疫接种巴氏杆菌疫苗,加之发病前期气候突然变化等应激因素影响,导致了此次鸭巴氏杆菌病的发生。加强饲养管理,正确免疫仍是控制鸭巴氏杆菌病的主要措施,利用禽巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗可以起到很好的预防效果。■

猜你喜欢
血清型氏杆菌霉素
血清检验和细菌检验在布鲁氏杆菌感染诊断中的效果及准确率分析
阿奇霉素辅助治疗呼吸道感染的临床效果
布氏杆菌病,你了解多少
试论羊布鲁氏杆菌的综合防控措施
阿奇霉素停药3天内不宜饮酒
2005~2011年厦门市食物中毒副溶血性弧菌的病原特征分析
常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定
鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定及耐药性分析
河南省信阳市鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和血清型分析
服阿奇霉素两个“不必”