蛋白动态变构调节与药物开发

（浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310051）

继揭秘DNA机制之后，变构调节成为生命活动中的第二大奥秘，而且它在细胞信号转导与疾病中承担着一个举足轻重的角色。变构调节（Allosteric regulation）的生物学表现为通过一个配体或者小分子结合到蛋白质的非活性区域（即变构位点）来调节该蛋白的功能活性。早在1906年前，Monod和Jacob就首次提出了一个新的概念—变构，用来解释酶活性的反馈调节机制，揭示了变构调节在代谢活性调控与蛋白合成控制中扮演了重要的角色[1-3]，这是对变构调节的经典诠释，主要针对的对象是折叠的寡聚体蛋白。变构调节主要由两部分组成，一部分是配体与蛋白质结合发生了相互作用。在这方面，变构调节有一个经典例子就是许多低聚蛋白的合作配体结合，其中底物与一个亚基的结合影响了其他相同亚基的配体亲和力。早期科学家们用MWC（Monod-Wyman-Changeux）和KNF（Koshland-Nemethy-Filmer）模型来解释这种协同性[4-5]；第一个模型强调对称守恒来稳定几种蛋白可能状态中的一种，而后者则假设了一个诱导拟合情形。韦伯证明了这两个模型都可以集成在一个通用的物理框架中，基于自由能解释的变构描述引入了相关术语变迁和构象选择。Cui和Karplus在其综述中对经典模型与变构的“新观点”之间的关系进行了明确的讨论，指出MWC/Weber形式主义已经包括了蛋白群体移动模型，来解释底物结合前后酶蛋白构象发生了巨大的变化[6-7]。另外一部分是共价修饰。现在变构调节不仅仅限制于配体与受体的联系，还把概念延伸到蛋白质的共价修饰如磷酸化，乙酰化或者交联。蛋白质的功能取决于不同构象状态之间的平衡，这种平衡可以被许多调节蛋白质活性的外部因素改变，包括局部的干扰，如翻译后修饰。细胞功能的调节可以通过多种机制完成，包括转录调节、选择性剪切、翻译调节、磷酸化和其他翻译后共价修饰、降解、定位、蛋白质—蛋白质相互作用和小分子变构效应物[8]。近几年来共价修饰的变构调节慢慢地成为了科学家们的研究热点，小分子可以与蛋白质进行结合和共价修饰如磷酸化或者乙酰化，从而调控了不同蛋白质之间的动态平衡，因此在下文中我们将着重就蛋白质变构调节与翻译后修饰展开论述。

1.小分子化合物的变构调节

在生物体中变构调节到底有多普遍呢？首先，变构是蛋白质和核酸分子感知细胞环境变化和维持细胞内环境稳定的一种方式。其实是变构提供了一种能够直接感知小分子水平的机制，它可以非常迅速，其扩散速率大约为108 M-1·s-1，并且很容易可逆。与磷酸化/去磷酸化等共价蛋白修饰的变化不同，变构信号转导中细胞能量不会被消耗。第二，自40年研究以来，相当大比例的蛋白质被认为是可以变构调节的，而且尽管已知蛋白质的数量急剧增加，但是已知的变构调节蛋白的数量却没有增加。科学家们在40年前发现一种蛋白质所需要的努力，与目前发现一种变构小分子化合物所需要的努力是一样的。如今，基因和蛋白质的发现是可以系统性对应起来的，但是效应小分子化合物的发现仍然是很稀少，因为这种变构小分子化合物的发现很耗费时间与精力，更为重要的是一般科学家们会在偶然间发现这种小分子，而且只有少数的科学家们愿意花时间与精力去挖掘这种小分子。所以一个变构小分子的发现是尤其值得科学家们继续挖掘深入。

由于过去几十年分子生物学技术的进步，我们对大多数这些变构机制的调控知识有了极大的扩展。这几年来，小分子调节的变构相互作用逐渐被演绎为一种新颖的变构调节方式。这些小分子化合物可以直接介导两个或多个蛋白相互作用，但是介导蛋白与蛋白相互作用的小分子是区别于那种结合受体的小分子，它是使用自然变构信号直接调节蛋白与蛋白相互作用的小分子。目前蛋白与蛋白相互作用（PPIs）网络或作用体已经通过高通量双酵母杂交技术定位到大约130000个，所以越来越多的文章涉及到变构调节参与到细胞生理和疾病中。变构调节发生在细胞膜，细胞质以及生命体的单个分子和多个蛋白复合体中，也会发生在DNA与DNA，DNA与蛋白的相互作用中。小分子变构引起的共价修饰如翻译后修饰会让蛋白质的三维结构发生变化，从而使蛋白质的功能在OFF到ON状态之间进行切换，通过刺激细胞信号通路以及分支来影响到细胞生理状态。综上所述，小分子变构调节对于细胞的生命活动是如此的重要，但是目前对于变构如何作用于生物分子水平的机制尚未阐述清楚。

2.翻译后修饰与动态变构调节

翻译后修饰是真核细胞中特有的调控方式。至少有1/3的蛋白经历着翻译后修饰变化，翻译后修饰可以调节一些信号通路中蛋白质的活性和转录因子结合底物DNA上来决定基因表达、细胞生长和分化。有些蛋白上会通过翻译后修饰来抑制蛋白与蛋白之间的相互作用。比如说Bcl-xl蛋白是凋亡抑制基因，自身的两条螺旋链（α1与α2）上拥有一些无序结构域IDRs，在一般情况下，Bclxl蛋白会与BH3蛋白结合从而增强其抗凋亡能力。在无序结构域上有几个位点会发生修饰如S62被磷酸化和N52/N66被脱酰胺，这些位点的突变都使得无序结构域的中心区域与Bcl-xl蛋白折叠核心区域的精氨酸残基结合引起构象改变，减少了Bcl-xl蛋白与BH3蛋白的亲和力，使得蛋白质们相互分离，从而抑制了其抗凋亡活性[9-10]。另外，P27蛋白定位于细胞核中，它会与CDK2和Cyclin A结合从而抑制CDK2和Cyclin A活性，使细胞周期不能进行。但是即使结合，P27蛋白上有些区域仍然很灵活，Tyr88可以被非受体酪氨酸激酶Abl，Lyn，Src磷酸化，从而使P27蛋白释放CDK2蛋白，促进了CDK2对P27蛋白的Thr187的磷酸化修饰。当P27蛋白的Tyr88和Thr187位点被磷酸化，则SCF泛素连接酶就会对P27蛋白进行泛素化修饰和被26S蛋白酶体降解，从而导致CDK2和Cyclin A与P27蛋白分离。游离态的CDK2和Cyclin A会慢慢积累，随之加强了P27蛋白的Thr187位点的磷酸化，最终使细胞周期顺利地从G1期过渡到S期，保证了正常的细胞周期运行[11-13]。

相反，有些蛋白会通过翻译后修饰来促进与其他蛋白结合。比如说LAT蛋白可以被ZAP70蛋白酪氨酸磷酸化，招募下游信号分子如带SH2结构域的Grab2蛋白来激活T-cell receptor。在这个过程中，从动力学上讲ZAP70蛋白磷酸化LAT程度很低，但是LAT是一个无序蛋白，它在一些远端的残基上也可以酪氨酸磷酸化，随着一连串的磷酸化反应，LAT蛋白构象开始伸展，与Grb2蛋白的结合能力越来越强，从而产生信号的放大。而且体外二维酶学实验也揭示了Grab2与LAT的相互作用和LAT的酪氨酸磷酸化的数目相关，当LAT的磷酸化位点逐个突变成苯丙氨酸，LAT与Grab2的亲和力越来越低[14-16]。

3.变构调节与药物开发

变构是调节生物大分子功能最直接、最有效的途径，从代谢机制的控制到信号转导途径。变构调制剂以变构位点为靶点，与以活性位点为靶点的正构配体相比，具有特异性强、副作用少、毒性低等明显优势。变构调节剂作为一种潜在的治疗药物，在新药的设计和开发中受到越来越多的关注。事实上，越来越多的变构调节抑制剂被FDA批准，慢慢进入临床试验阶段。例如HSP70的变构调节是比较经典的。HSP70分子伴侣在应激环境下和生理状态下发挥了巨大的作用。伴侣分子的活性需要其C末端底物结合域(SBD)与底物多肽短而疏水的肽段的短暂相互作用，而这种相互作用是通过N末端核酸结合域（NBD）来调节的。当在没有核酸结合和ADP结合的状态下，NBD与SBD两个结构域是独立的，它们之间只有一个高度保守的短链相连接。SBD由两个亚结构域组成，SB口袋结构中的两层beta三明治结构（SBDβ）和α螺旋的盖子结构域相互交缠在一起，所以SBD对底物具有很高的亲和力。一旦ATP结合上去，NBD两条侧链就会相互缠绕，SBD的两个结构域就会分离，分别结合到NBD上去，导致底物结合率和解离率分别增加2到3个数量级，使底物亲和力降低。ATP水解会使HSP70增加对底物的亲和力，其中苯丙氨酸146位与ATP结合导致HSP70释放了底物。针对这一机制，科学家们设计了抗癌药物—MKT-077，它可以结合到HSP70的ADP结合位点上，干预蛋白与蛋白的相互作用，阻止NBD的loop222的运动，最终使乳腺癌细胞不能增殖[17-18]。

还有AKT(蛋白激酶B, PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于AGC激酶家族。它被发现为小鼠白血病病毒AKT8致癌基因，在人类中由三个基因AKT1、2和3编码。AKT家族成员影响多种生物学功能，包括细胞增殖生长、代谢、蛋白合成、迁移、血管生成和抗凋亡能力。为了让AKT调节这些功能，其激活过程是必不可少的。AKT的充分激活需要转位到质膜，然后其苏氨酸308和丝氨酸473残基同时被磷酸化，这两个残基的磷酸化被PI3K/AKT/mTOR通路中的多种蛋白调控[19-20]。在这个通路中，PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇(3,4)二磷酸(PIP2)到磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)。PI3K依赖性激酶1 (PDK1)和AKT的同源(PH)域均与位于质膜的PIP3结合，从而使PDK1磷酸化AKT的Thr308位点。通过mTORC2/rictor复合物，AKT在疏水基序c端Ser 473处磷酸化，完成活化过程。一旦被激活，AKT磷酸化下游的靶蛋白，包括PRAS40、GSK3、FOXO和BAD[2]。另外，AKT还通过磷酸化TSC1和TSC2来抑制其抑制作用，从而激活mTORC1，最终导致4E-BP1和S6K磷酸化[21]。ARQ 092和下一代化合物ARQ 751是高选择性的广谱AKT抑制剂。鉴于AKT1-E17K突变的重要性，在癌症和其他疾病中这种靶向突变可能成为ARQ 092和ARQ 751等AKT抑制剂的潜在位点。体外生化结合实验表明，在纳米级浓度下，ARQ 092和ARQ 751与AKT1-WT和AKT1-E17K突变体结合紧密一个ARQ 092的类似物的晶体结构，它们结合在激酶和PH域界面之间形成的变构口袋里[22-23]。ARQ 092不仅作为单一药物，而且与其他药物联合应用于多种肿瘤模型中，具有较强的肿瘤生长抑制作用。

蛋白质—蛋白质相互作用(PPIs)因其在健康和疾病环境中的重要意义而成为具有广泛治疗价值的药物靶点。因此，它们被广泛认为是药物开发的圣杯。从历史上看，PPIs因其庞大、扁平、无口袋的结构而被认为是“不可用药的”。目前对这些“棘手”靶点的药物治疗尝试包括正构和变构方法。以往采用蛋白质疗法和小分子等正位法的研究常常因难以直接定位PPI接口而导致药物性能低下。随着结构生物学的快速发展，变构调制器已经逐渐成为一种潜在的解决方案。变构囊位于PPI正构位点的远端，其配体不需要与PPI配体竞争，有助于改善变构PPI调节剂的理化和药理特性。因此，利用变构调节来调控PPIs被认为是未来PPI药物开发的一个诱人策略。

4.结语

本文中所讨论的变构调节是指小分子代谢物与一些酶结合后，使得一些酶的活性发生了改变，从而对细胞的生理功能产生了一些影响。变构调节中的共价修饰部分在肿瘤代谢中尤为重要，特别是在蛋白与蛋白相互作用、信号通路转导等方面发挥了巨大的作用。最近发表的一系列论文表明，蛋白质或DNA的变构在进化或生理过程中发挥着各自的生物学作用。这种如突变、磷酸化以及在蛋白质或DNA结构的任何位置与小分子的反应，会导致构象的分布发生变化。变构结构的不可逆变化或变构开关的异常是引起疾病的原因。这些变构可能共享相似的信号通路，在疾病发展中形成网络调控，可能为新药提供有前景的治疗选择。因此，变构在基因调控中起着关键作用，可以作为开发疾病新疗法的新选择。