染发剂中7 种禁用染料测定方法的优化

彭乃焕,黄忠亮

（百色市食品药品检验所，广西百色533000）

1 引言

随着生活品质的提高，人们越来越注重个人形象，染发剂作为一种美容美发方式，成为当今社会的流行时尚。目前市场上的染发剂大部分属于氧化型染发剂，其主要染发成分为苯胺类和苯酚类有机化合物，这些化合物对人体健康都有不同程度的伤害[1，2]，超标超范围使用是监管的重点，我国《化妆品安全技术规范》（后简称“规范”）（2015 年版）[3]中限定了74 种准用染发剂，并规定了对苯二胺等32 种组分的检测方法（后简称“标准方法”），笔者在对58 批染发剂按标准方法开展日常检验后发现：部分样品在离心处理后溶液浑浊或乳化凝结，造成过滤困难；部分样品稳定性较差，平行测定结果偏差较大。为了完善标准方法，本研究通过查阅相关文献[4～7]，对标准方法中的前处理、色谱条件等进行优化，对优化后的方法进行方法学考察，为日常检验提供参考。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

SHIMADZU LC-20AB 高效液相色谱仪，配备SPD-M10Avp 检测器，LC solution 色谱工作站（日本岛津公司）；XS205DU 分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LD5-2A 离心机（北京京立离心机有限公司）；VXMNAL 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）。

标准品：间苯二胺、邻氨基苯酚、2-硝基对苯二胺、甲苯-3.4-二胺、N,N-二乙基甲苯-2.5-二胺盐酸盐，德国Dr.Ehrenstorfer 公司；邻苯二胺，德国j&k 公司；氢醌，北京BePure 公司。甲醇(色谱纯，美国Fesher 公司)，亚硫酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、庚烷磺酸钠、磷酸及乙醇均为分析纯。样品主要来源于2019 年监督抽验样品。

2.2 实验方法

2.2.1 溶液配制

亚硫酸氢钠—乙醇混合溶液（下称：硫醇液）：2g/L 亚硫酸氢钠溶液∶50%乙醇溶液（1∶1）混合。

磷酸盐混合溶液：称取十二水合磷酸氢二钠1.8g、磷酸二氢钾2.8g 和庚烷磺酸钠1.0g，用水溶解并定容至1L，用磷酸溶液（1→10）调节pH 至6。

2.2.2 混合标准储备溶液的制备

称取各染料标准品20mg（精确至0.01mg），分别置10mL 容量瓶中，加入硫醇液溶解并定容至刻度，制成单一标准储备溶液。吸取各单一标准储备溶液1mL，置10mL 容量瓶中，加硫醇液定容至刻度，制成混合标准储备溶液（约0.2mg/mL），置-20℃避光保存。

2.2.3 混合标准工作溶液的配制

准确吸取混合标准储备溶液适量，用硫醇液稀释，配制成浓度为 5、10、20、40、80μg/mL 的混合标准工作溶液。

2.2.4 色谱条件

色谱柱：RP-AMIDE C16 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相 A 为甲醇∶磷酸盐混合溶液（10∶90），流动相 B 为甲醇，梯度洗脱:0～10min，100%A ，10～30min，100%A ～60%A；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；检测波长：290nm；柱温：25℃。

2.2.5 样品处理

称取样品0.3g（精确至0.001g）于塑料离心管中，加入1.0g 硅藻土，玻棒搅拌使膏状样品分散于硅藻土上，精密加入硫醇液至20mL，涡旋1min，离心（5000rpm）3min，取上清液经微孔滤膜（0.45μm，25mm）过滤，滤液作为供试溶液。

2.2.6 方法检出限(MDL)评估

取混合标准储备溶液适量，加入到空白样品中，按“2.2.5”项下方法，制备浓度为 5、10、20、30、40、50、60μg/g 的检出限系列供试溶液，按“2.2.4”项下色谱条件，在3d 内各浓度水平随机测定10次。以浓度为横坐标，阳性检出（信噪比≥3）百分率为纵坐标，绘制阳性检出曲线，以拐点相对应的浓度作为信噪比评估法的MDL。

3 结果与分析

3.1 样品前处理的优化

标准方法中取样量为0.5g，提取溶液为50%乙醇水溶液，提取溶液体积为10mL。在日常检验中发现：部分样品提取液乳化或凝结，难于通过0.45μm 微孔滤膜；部分样品配方中未见加入亚硫酸氢钠或异抗坏血酸，制得的供试溶液容易氧化分解，影响测定结果。为了消除染发剂基质中增稠剂和凝胶剂的影响，防止供试溶液被氧化，本研究调整取样量为0.3g，并加入硅藻土吸附增稠剂和凝胶剂，提取溶液改为硫醇液，提取溶液体积为20mL，调整后乳化凝结现象减少，离心后易分层，上清液容易过滤。

3.2 色谱条件优化

采用乙腈+磷酸盐混合溶液（10+90）作为流动相时，3 号峰与4 号峰分不开，以甲醇代替乙腈后，两者分离效果好，但N,N-二乙基甲苯-2.5-二胺盐出峰时间太迟，采用梯度洗脱并进行预混合模式，减少基线飘移，优化后的方法系统适应性良好，见图1。

图1 7 种染料的色谱图

3.3 线性关系

将混合标准工作溶液按“2.2.4”项下色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到对应的线性方程及相关系数，见表1。

表1 各组分线性方程和相关系数

3.4 加标回收实验

在 5、20、80μg/mL 3 个浓度水平进行加标回收试验，取空白样品，加入混合标准储备溶液适量，每个浓度水平平行制备3 份，按“2.2.4”项下色谱条件测定，计算各组分的回收率及相对标准偏差（RSD），结果回收率分别为：99.2%，98.2%，99.1%，100.2%，100.1%，97.2%，101.3%，RSD 为：1.8%，2.6%，1.3%，2.5%，3.1%，1.5%，2.2%。

3.5 检出限与定量限

本方法检出限为10～40μg/g。定量限以3 倍检出限确定，即为 30～120μg/g。

3.6 混合标准储备溶液稳定性试验

取混合标准储备溶液，分别于配制后0d、7d、14d、21d、30d 时测定，结果各组分的峰面积相对标准偏差<5%，表明混合标准储备溶液在-20℃避光保存条件下质量稳定。

3.7 样品测定

选取4 批膏状氧化型染发剂的留样样品进行测定，并将测定结果与标准方法的结果相比较，结果有2 批样品疑似检出间苯二胺，经与间苯二胺标准光谱图进行相似度检查，确定不是间苯二胺，4 批测定结果与标准方法的测定结果一致。

4 结语

优化后的方法同时测定了染发剂中7 种禁用染料，7 种染料在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数 r 均>0.9999，检出限为 10～40μg/g，定量限为 30～120μg/g，回收率为 91.7%～106.1%，相对标准偏差（RSD）为0.15%～2.61%。优化后的方法，样品前处理简单快捷，7 种禁用染料色谱峰分离效果佳，检测灵敏度高、准确性好，适用于染发剂中7 种禁用染料的定性鉴别和定量检测。