GC-MS法分析枯草芽孢杆菌HS8挥发性成分

万璐，闫佳佳，许哲祥，姜硕，郑春英*

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 生命科学学院，黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080)

作为常用益生菌之一，枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中[1]，属于革兰氏阳性非致病菌[2]，既不引起人和动物产生疾病，也不污染环境[3]，还能产生多种抗生素及广谱抗菌活性的抑制性酶[4]，同时，枯草芽孢杆菌具有较强的抗逆性，能够耐受机体、生产、运输、保存等过程中遇到的各种不良环境条件的变化[5]，在药品生产、食品发酵、调味品等方面被广泛应用[6-8]，产生了巨大的生态效益、经济效益和社会效益[9]。

枯草芽孢杆菌HS8(BacillussubtilisHS8)为黄芪内生细菌，具有明显、清新、持久、愉悦的香味，为了开发枯草芽孢杆菌HS8并合理利用其芳香气味，本文以黄芪生药为对照，采用GC-MS法分析枯草芽孢杆菌HS8的挥发性成分，系统分析比较枯草芽孢杆菌HS8挥发性成分与宿主植物黄芪之间的相关性，并确定其芳香活性物质，旨在合理开发新型芳香性枯草芽孢杆菌调味品，为扩大枯草芽孢杆菌的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌HS8(BacillussubtilisHS8)：由黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室分离自健康黄芪植株；健康野生膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus)：采自黑龙江省大兴安岭地区；NA、NB培养基配制方法参阅文献[10]；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A GC-240MS GC-MS 联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备

枯草芽孢杆菌HS8发酵液样品的制备：参阅文献[11]，将HS8菌株接种于NA培养基，于37 ℃条件下恒温活化培养3 d，取活化后的HS8菌株，在无菌条件下挑取菌丝体接种于60 mL NB培养基中，于37 ℃、120 r/min条件下摇床振荡培养3 d，制成1×107CFU/mL的培养液；将种子液以5%(V/V)的接种量转接至300 mL灭菌后的NB培养基中，于37 ℃、120 r/min摇床培养5 d，将发酵液真空抽滤后，于50 ℃条件下减压浓缩，将浓缩后的HS8菌株发酵液用乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，于50 ℃低温浓缩至干，用适量乙酸乙酯溶解，作为发酵液供试样品，备用。

枯草芽孢杆菌HS8菌丝体样品的制备：分别提取HS8菌株菌丝体，超声破碎，并以乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，以下步骤同“枯草芽孢杆菌HS8发酵液样品的制备”，作为菌丝体供试样品，备用。

对照药材溶液的制备：分别称取黄芪根及黄芪茎的干燥粉末各10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超声提取1 h，过滤后于50 ℃减压浓缩至10 mL，用0.45 μm有机微孔滤膜过滤，作为黄芪对照药材液，冷藏备用。

空白对照品溶液的制备：取NB培养基(不接种内生细菌)，于50 ℃减压浓缩，同“枯草芽孢杆菌HS8发酵液样品的制备”处理，作为培养基空白对照品，备用。

1.3.2 GC-MS条件

MS条件：电子轰击(EI)离子源；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟2.5 min；数据采集方式为Scan；检测器增益电压1.18 kV；质量扫描范围40～450 m/z。

1.3.3 分析测试

采用 GC-MS对HS8菌株挥发性成分进行分析，质谱峰数据经质谱数据库检索比对[12]，确定样品挥发性成分中的主要成分，使用面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分总离子流图

采用GC-MS法，分别对枯草芽孢杆菌HS8发酵液、菌丝体、黄芪根、黄芪茎及空白培养基对照品进行挥发性成分分析，其总离子流图见图1～图5。

图1 HS8发酵液挥发性成分GC-MS总离子流图

图2 HS8菌丝体挥发性成分GC-MS总离子流图

图3 黄芪根部挥发性成分GC-MS总离子流图

图4 黄芪茎挥发性成分GC-MS总离子流图

图5 NB培养基挥发性成分GC-MS总离子流图

由图1～图5可知，枯草芽孢杆菌HS8发酵液中分离出挥发性物质37种，鉴定了其中的21种成分；菌丝体中分离出22种，鉴定了其中的18种成分；黄芪根中分离出挥发性物质16种，鉴定了其中的14种成分；黄芪茎中分离出34种，鉴定了其中的17种成分；空白培养基中含有7种挥发性物质，鉴定了其中的4种成分。

2.2 枯草芽孢杆菌HS8挥发性成分分析

以宿主植物黄芪为对照，对枯草芽孢杆菌HS8挥发性成分进行分析，结果见表1和表2。为排除培养基中成分对分析结果的干扰，同法对空白培养基也进行了挥发性成分的分析，结果见表3。

表1 枯草芽孢杆菌HS8挥发性成分GC-MS分析结果

表2 黄芪挥发性成分GC-MS分析结果

表3 NB培养基挥发性成分GC-MS分析结果

对比表1～表3分析结果可知，除去与培养基中相同的挥发性成分，在枯草芽孢杆菌HS8发酵液及菌丝体挥发性成分中均含有与黄芪根、茎相同的正二十七烷；同时，在枯草芽孢杆菌HS8菌丝体挥发性成分中检测出β-谷甾醇，而在黄芪根挥发性成分中却存在γ-谷甾醇；此外，枯草芽孢杆菌HS8发酵液及菌丝体挥发性成分中还存在其特异性挥发性成分。

3 结论

分离自健康野生黄芪植株的枯草芽孢杆菌HS8可产生清新、愉悦、持久的香味，GC-MS分析表明，枯草芽孢杆菌HS8含有大量挥发性成分，这些成分中存在着与宿主植物黄芪相同、相似及全新的挥发性成分，说明枯草芽孢杆菌HS8与宿主植物黄芪可能具有相同的代谢机制。作为农业部和FDA认定的安全性菌株[13,14]，枯草芽孢杆菌的开发与利用正在成为当今研究的热点之一，上述研究为枯草芽孢杆菌HS8作为益生菌在调味香料的生产方面奠定了基础[15]，提供了新资源，不仅能够弥补调味香料植物生产方面的不足，同时也为内生细菌与宿主植物的互作机理提供了研究基础。