适合奶醋发酵的酵母菌发酵动力学

姚妞妞，常春晖，于宏伟，郭润芳

(河北农业大学 食品科技学院，河北 保定，071000)

牛乳的主要营养成分为乳脂肪、乳蛋白、乳糖等，其中乳脂肪是主要的能量物质，乳蛋白包含人体必需的8种氨基酸，乳糖能维持牛奶甜度，促进营养物质吸收[1]。利用牛乳为原料的乳饮品种类较多，如酸乳饮料，它分为发酵型和配制型，前者营养成分高、风味好[2]。发酵型奶醋作为一种新型饮品，国内外对它的研究较少，据产品介绍恒顺发酵型奶醋是利用了酵母菌、乳酸菌和醋酸菌经过二次发酵制备而成，它既包含乳酸菌饮料的营养又包含醋饮料的保健功能。我国对于奶醋饮料的研究报道较多的是配制型奶醋的制备及功能，如李敏等[3]利用脱脂奶粉和镇江白醋等为主要原料制作配制型奶醋饮料；再如管娴月等[4]探究富硒轮梗霉与奶醋对小鼠降血脂和抗氧化作用的影响。但对于发酵型奶醋，仅发现我国恒顺发酵型奶醋走高端市场的报道[5]，尚未有关于菌株及工艺相关研究的报道。

奶醋发酵与果醋发酵机理相同，涉及2个阶段的微生物代谢过程，一是酵母菌利用糖在厌氧条件下发酵生成酒精，二是醋酸杆菌在有氧条件下将酒精氧化成醋。因此，优良发酵菌株的选择是制备发酵型奶醋的关键。据报道，乙醇是醋酸发酵的底物，并为醋酸菌的生长代谢提供能量，当乙醇体积分数超过4%时，醋酸菌的生长会受到抑制[6]。乙醇体积分数超过10%时，抑制醋酸菌生长，钝化其氧化酒精的能力，引起乙醛积累[7]，故选择酒精体积分数不超过10%的酵母菌株，有利于维持奶醋发酵工艺的稳定性。研究乙醇发酵动力学的目的在于通过发酵动力学的研究来进行最佳发酵工艺条件的控制[8]，因此酵母发酵动力学对奶醋的开发有重要的指导意义。

发酵动力学是将发酵过程中与菌体繁殖、基质消耗、产物生成等参数进行定量分析，研究他们之间的动态定量关系，更准确地对参数进行预测，这对发酵过程有重要的指导意义[9]。引入数学模型整理实际发酵过程中得到的大量数据，并以简洁的形式进行表达，可以更好地控制发酵过程，并可利用小试验获得数据设计大规模的发酵工艺过程[10-11]。常用Logistic方程[12]表达菌体生长动力学；酵母菌体生长与酒精生成属于部分偶联关系，一般用Leudeking-Piret方程[13]表达酒精生成动力学；底物消耗用于菌体生长和代谢生成产物的消耗，一般用Leudeking-Piret方程表达底物消耗动力学。非线性拟合方法[14]是发酵动力学模型较为经典的算法之一，本研究将采用非线性拟合方法，建立发酵动力学方程，这将有利于准确的掌握以牛乳为原料的酵母发酵规律，了解发酵过程的各项指标[15]，对下一步发酵奶醋有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

Saccharomycescerevisiae4-2，S.cerevisiae4-3，S.cerevisiae6-1，S.cerevisiae6-2，河北农业大学酶工程实验室保藏；安琪干酵母、安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.2 试验试剂

蔗糖，上海麦克林生化科技有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技有限公司；苯酚，上海麦润尔化学技术有限公司；纯牛奶，内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.3 仪器与设备

Synergy HTX型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；TDZ5-WS型高速冷冻离心机，长沙湘锐离心机有限公司；ZHWY-2102C型摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.4 菌株发酵条件

分别挑取斜面保存的2株酵母菌，接种于YPD液体培养基中，30 ℃培养12 h进行活化，然后按照不同的接菌量接种于YPD液体培养基中，并分别于不同温度条件下培养，用平板计数法计算活菌数，以活菌数为衡量指标，确定了最适接菌量为2%，最适发酵温度为30 ℃。

分别挑取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母斜面保存的菌种，接种于YPD液体培养基中，30 ℃培养12 h活化后，分别吸取发酵液体积2%的活化后的2株酵母菌，接种于添加蔗糖质量浓度分别为0、50、100、150 g/L的纯牛奶中，密闭培养，摇床转速200 r/min，每间隔8 h取1次发酵样品进行测定。

1.5 测定方法

1.5.1 感官评价

参考文献[3]中对配制型奶醋的感官要求，制定出感官评分标准。选定8名相关专业人员作为评定员(从事于食品工程、食品营养与分析、食品质量与安全专业)。发酵24 h后，分别取一定量的各组样品进行感官评定。所评定的感官指标为色泽、口感、组织状态和风味，如表1所示。

表1 酵母菌感官评分标准Tab.1 Yeast sensory scoring criteria

1.5.2 总糖标准曲线的测定

硫酸苯酚法[16]测可溶性总糖含量。取0.5 mL发酵液，加入1 mL 20%(体积分数)的三氯乙酸对发酵液中的各类蛋白进行沉淀，再离心取上清液对其进行稀释。取1 mL的稀释液，加入500 μL 9%(体积分数)的苯酚溶液，摇匀，再加入2.5 mL的浓H2SO4。比色液总体积为4 mL，在室温下放置30 min，显色。在485 nm处测得吸光值。

硫酸苯酚法测定不同浓度梯度的糖含量的变化与OD值之间的关系，得出标准曲线方程为y=0.013 2x+0.032 7，相关系数R2=0.999 6，线性相关性良好，可以直接从标准曲线上求得样品糖的浓度。

1.5.3 酵母发酵时菌落数的测定

纯牛奶经发酵后测其活菌数，发酵至相应的时间时，将发酵液进行10倍梯度稀释选取适宜的浓度后吸取1 mL，采用倾注法使其于温度适宜的固体YPD培养基混匀，于30 ℃恒温培养箱培养24 h后进行菌落计数[17]。

1.5.4 底物残糖的测定

方法同总糖标准曲线的测定方法，采用硫酸苯酚法。

1.5.5 酒精度的测定

参考GB/T 23546—2009中对酒精测定的方法[18]，并稍加改进。取10 mL试样与10 mL蒸馏水于蒸馏瓶中，加热蒸馏，馏出液体积约9.5 mL时停止蒸馏，于水浴冷却至20 ℃时，测定温度和酒精度，并换算单位20 ℃时的酒精度。

1.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 发酵菌株的筛选

各菌株发酵牛乳后的感官评价结果如表2所示。

表2 感官分析分值与产乙醇量Table 2 Sensory analysis scores and ethanol production

由表2可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母的感官评分最高，分别为93.5分和95.5分，故选取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母作为本试验研究的菌株。

2.2 酵母菌发酵过程中的物质变化

使用不同初始蔗糖质量浓度(0、50、100、150 g/L)的纯牛奶发酵，在对应的时间点测定酵母菌发酵过程中的物质变化。

2.2.1 发酵过程中菌体生长变化

菌体生长变化结果如图1所示。在发酵过程中，2株酵母菌的菌体生长整体趋势均先增高后趋于平稳，且在发酵24 h达到最大值。质量浓度为50 g/L以上的蔗糖在稳定期菌量差异不显著，均稳定在108CFU/mL。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图1 不同蔗糖添加量的牛奶中菌体生长变化Fig.1 Changes of bacterial growth in milk with different sucrose additions

2.2.2 底物蔗糖的消耗

底物糖的变化结果如图2所示。在发酵过程中，2株酵母菌的底物糖的消耗均整体逐渐降低。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图2 不同蔗糖添加量的牛奶中底物蔗糖含量的变化Fig.2 Changes of sucrose content in the substrate of milk with different sucrose additions

2.2.3 产物酒精的生成

由图6可见，建立的雷公藤一致性模型可准确地验证被测药材是否为雷公藤，包括雷公藤的地方习用品昆明山海棠（验证集D）也能够以较高的最大CI值（大部分最大CI值＞30.0）与雷公藤作出区分。

产物酒精含量的变化结果如图3所示。在发酵过程中，2株酵母菌产物酒精的含量总体均呈上升趋势，先缓慢增长再快速增长，最后趋于平稳。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图3 不同蔗糖添加量的牛奶中产物酒精含量的变化Fig.3 Changes of alcohol content in milk with different sucrose additions

2.3 发酵动力学模型的建立

2.3.1 菌体生长动力学模型

描述菌体生长最常用的是Monod模型，它是基于3个假设建立的。一是菌体生长为均衡型，即菌体生长的唯一变量是菌体浓度；二是培养基中只有一种底物是限制性因素，其他营养成分不影响菌体生长；三是菌体的生长视为单一反应，细胞得率是常数。但Monod方程只适合细胞生长较慢、细胞密度较低且无抑制作用的环境下。这不适合应用于酵母乙醇发酵过程，较为普遍采用Logistic方程。在纯牛奶酒精发酵过程中，采用平板计数的方法测定的酵母菌生长趋势变化规律遵循典型的“S”型曲线[20]，因此可用Logistic方程描述菌体生长的变化规律，该方程能较好的反映发酵过程中由于菌体浓度的增加对其自身生长繁殖所产生的抑制效应[21-23]。该方程如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

对公式(1)积分得：

(2)

式中：X0,初始菌体量；Xm,最大菌体量；μm,最大比生长速率。

用非线性曲线拟合的Logistic方程对2株酵母菌体生长的试验数据进行拟合，图4为酵母菌生长动力学曲线。酵母菌体动力学拟合的相关参数如表3所示。

a-S.cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图4 不同初始蔗糖浓度的菌体生长实测值与拟合曲线Fig.4 Measured values and fitted curves of bacterial growth at different initial sucrose concentrations

如图4所示，0～24 h时2株酵母菌菌体均快速增长，至进入稳定期酵母菌量都基本维持不变。由表3可知，拟合的R2>0.950，说明拟合度较好。

表3 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精发酵酵母菌生长动力学参数Table 3 Growth kinetic parameters of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast alcohol fermentation yeast

2.3.2 底物蔗糖消耗动力学模型

底物蔗糖的消耗包括了用于菌体生长及产物代谢方面的消耗，包括了3个方面：一是用于菌体生长的消耗，以合成新酵母；二是酵母维持基本生命活动的消耗；三是用于产物生成的消耗。根据底物消耗物料衡算，可以得到底物消耗的动力学模型，一般用Leudeking-Piret模型表示[24]，如公式(3)、公式(4)所示：

(3)

对公式(3)积分得：

(4)

式中：Yx/s，菌体对底物的得率系数；ms酵母代谢的维持系数。

将菌体生长的Logistic方程公式(2)以及菌体生长的动力学相关参数分别代入公式(4)，即可求得底物消耗动力学模型拟合曲线。底物蔗糖消耗的拟合曲线如图5所示。底物蔗糖消耗动力学拟合的相关参数如表4所示。

表4 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母发酵时底物蔗糖消耗的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of substrate sucrose consumption during fermentation of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图5 不同初始蔗糖浓度的底物蔗糖消耗的实测值与拟合曲线Fig.5 Measured values and fitting curves of substrate sucrose consumption at different initial sucrose concentrations

如图5所示，2株酵母菌在发酵的56 h内，随着时间的变化，底物蔗糖的浓度逐渐减小，56 h时达到最小值。由表4可知，拟合的R2>0.950，说明拟合度较好。

2.3.3 酒精生成动力学模型

在酒精发酵过程中，根据菌体生长与产物形成是否偶联，分为3类：偶联型、部分偶联型和混合型。由于酵母的生长伴随着酒精的生成，酒精的生成过程与酵母的生长关系被看作是生长偶联型，最常用的模型Leudeking-Piret方程来描述酒精生成与酵母菌体数量的关系。方程如公式(5)、公式(6)所示：

(5)

式中：α为生长相关系数；β为非生长相关系数。

当公式(5)α≠0且β=0时为偶联型；当公式(5)α=0且β≠0时为部分偶联型；当公式(5)α≠0且β≠0时为混合型。

对公式(5)积分得：

(6)

将菌体生长的Logistic方程公式(2)以及菌体生长的动力学相关参数分别代入公式(6)，即可求得产物酒精生成动力学模型拟合曲线。图6为产物酒精生成的拟合曲线。产物酒精生成动力学拟合的相关参数如表5所示。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母图6 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精发酵产酒精动力学参数Fig.6 Kinetic parameters of alcohol production by S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

如图6所示，0～24 h时，2株酵母菌的发酵产物酒精的含量总体均呈上升趋势，先缓慢增长再快速增长，最后趋于平稳。由表5可知，拟合的R2>0.950，说明拟合度较好。

表5 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母发酵产物酒精生成的动力学参数Table 5 Kinetic parameters of alcohol production from fermentation products of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

综上，考虑到菌体生长、底物糖的消耗、酒精的生成情况，不同初始蔗糖质量的牛乳中，达到最大菌体量稳定期的时间基本相同，底物蔗糖的消耗基本一致；考虑生成的奶醋发酵的酒精量时，S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖质量浓度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖质量浓度较为合适。现数据经软件处理，选用自定义参数拟合，经过非线性拟合后获得各个发酵动力学参数，将其模型参数代入动力学模型中，得动力学模型方程，汇总如表6。

表6 发酵过程拟合方程及其相关系数Table 6 Fitting equation of fermentation process and its correlation coefficient

2.4 模型验证

由表7可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母3个模型的理论值和试验值的误差大部分<10%，S.cerevisiae4-2的3个模型理论值和试验值的误差的平均值分别为6.61%、8.12%、6.51%，安琪干酵母的3个模型理论值和试验值的误差的平均值分别为6.05%、7.37%、5.95%，说明模型拟合较好。

3 结论

本研究通过感官评价筛选出适合奶醋发酵的酿酒酵母(S.cerevisiae)4-2和安琪高活性干酵母，其发酵动力学表明S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖质量浓度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖质量浓度在不同的发酵时间内，产生乙醇的体积分数都在10%以下，符合奶醋发酵的要求。

表7 模型理论值和试验值的比较Table 7 Comparison of theoretical values of the model and the laboratory

以蔗糖为底物的动力学模型，无论是菌体生长模型、底物消耗模型还是酒精生成模型，拟合度均较好，且2株酵母菌的3个模型的理论值和试验值的误差大部分<10%。因此，建立的理论模型可以较好的预测奶醋的发酵过程，从而进一步掌握酵母发酵牛乳过程中物质的动态变化规律，为最佳发酵工艺条件的控制提供理论基础，对奶醋的制备有重要的指导意义。

另外，本研究也有需要改进的地方，例如，发酵初期并未完全做到无氧发酵，也并未考虑底物蔗糖的浓度对菌体生长的抑制作用等。所以，未来的动力学研究应尽可能完善无氧发酵条件，底物和产物的抑制作用等，这将对进一步掌握发酵过程发挥很大的作用。