TG酶对金线鱼鱼糜3D打印效果的影响

王嵬，杨领，李学鹏，励建荣，仪淑敏，谢晶，王轰，劳敏军

1.渤海大学实验中心，锦州 121013； 2.渤海大学食品科学与工程学院/辽宁省食品安全重点实验室/生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，锦州 121013；3.上海海洋大学食品学院，上海 201306； 4.蓬莱京鲁渔业有限公司，烟台 264010；5.浙江兴业集团有限公司，舟山 316101

谷氨酰胺转氨酶(transglutiminase,TG酶)根据来源不同可分为组织谷氨酰胺转氨酶和微生物谷氨酰胺转氨酶，被称为“21世纪超级黏合剂”，可通过催化蛋白多肽链上的酰基转移反应，来促进蛋白质之间的交联形成一种致密的网状结构，又称为凝胶结构[1]。

目前，关于利用TG酶来改善凝胶特性的研究有很多。郝凤霞等[2]研究了不同添加量的TG酶对肉燕品质的影响，研究表明分别在肉燕中添加0、0.25%、0.50%、0.75%的TG酶后，随着TG酶添加量上升，样品的感官评定和相关性质都得到改善；程琳丽等[3]以罗非鱼为原料，通过添加不同含量的TG酶，研究其保水性的变化，研究表明经过TG酶处理过的罗非鱼在浸泡后增重率均大于6.5%，当TG酶的添加量为0.6%时增重率最高为8.04%，解冻率最低为3.4%，相比于其他组保水率最高。Dong等[4]研究了TG酶对马鲛鱼3D打印效果的影响，表明当TG酶添加量为0.2%、0.3%时，马鲛鱼鱼糜的表观黏度较符合3D打印，随着TG酶添加量的上升，马鲛鱼鱼糜的硬度、黏附性逐渐升高。

本研究从表观黏度和流变特性(输送难易程度)、打印效果(外观形貌、定型性)、鱼糜制品特性3个方面分析了TG酶对金线鱼鱼糜3D打印特性的影响，以期为蛋白凝胶体系的3D打印提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金线鱼鱼糜(AA级),青岛锦灿食品有限公司；TG酶(酶活 120 U/g),泰兴市东盛食品科技有限公司；尿素、β-巯基乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；质量分数25%戊二醛,分析纯，天津市福晨化学试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和无水乙醇，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UMC5斩拌混合乳化多功能一体机，德国Stephan机械有限公司；BiofugeStratos型高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MCR302 流变仪，奥地利Anton Paar公司；UV-2550紫外可见光分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；TA.XT.Plus型质构仪，英国Stable Micro System公司；FJ200-SH数显高速分散均质机，上海标本模型厂；FSE23D打印机，昆山博力迈3D打印科技有限公司；INMI20型核磁共振成像，上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 试验方法

1)鱼糜浆料的制备及3D打印参数。将鱼糜从-20 ℃冰箱中取出，静水解冻。解冻后将鱼糜切成长方体状(长约10 cm，宽约5 cm，高约5 cm)，放入斩拌混合乳化多功能一体机中，0.06 MPa真空度条件下斩拌3 min，加入质量分数1.5%的NaCl溶液继续在0.06 MPa真空度条件下斩拌3 min，调节水分含量至80%，并添加TG酶(0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)，在0.06 MPa真空度条件下斩拌3 min；斩拌过程中温度始终低于10 ℃，将鱼糜取出存放至蒸煮袋中。3D打印之后将样品放置在4 ℃条件下保存12 h后备用。

设定打印参数为：喷嘴直径为1.5 mm，层高值为1.5 mm，打印高度为5 mm，打印速率为30 mm/s，打印温度在35～45 ℃，出料速率在0.003 cm3/s。打印后不需加热。

2)凝胶强度的测定[5]。样品前处理：将样品切为直径2.5 cm、高2.5 cm的圆柱体，于室温下放置30 min后，于TA-XT plus型物性分析仪上利用凝胶强度分析模式进行测定。每组样品(TG酶添加量分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)，做10次平行试验。

参数：探头型号P/5S(球形探头直径5 mm)，测定速率1 mm/s，穿刺距离15 mm，触发力10 g。

3)质构的测定。样品前处理同本文“1.3 2)”。采用TPA模式测定参数设定：探头型号P/50，测定速率 1 mm/s，形变程度 30%，压力为5 g，以此来测得打印材料的质构特性。

4)表观黏度和静态剪切流变的测定。样品前处理同本文“1.3 2)” 。表观黏度参数设定：时间设置为60 s，温度为25 ℃，固定剪切速率为 1 s-1，平板直径为 20 mm，间隙为1 mm；以此来测定打印材料的表观黏度，每个样品做5次平行，取平均值。静态剪切流变的测定：设定温度为25 ℃，采用直径为20 mm平板，在1 mm的间隙下和0.1～150 s-1扫描范围的剪切速率对静态剪切流变曲线进行测定。通过 Herschel-Bulkley的数学模型对数据进行整合计算，方程为：

τ=τ0+Kγn

(1)

公式(1)中剪切应力(τ)、屈服应力(τ0)、剪切速率(γ)、指流动指数(n)、稠度系数(K)是衡量材料非牛顿流体性质的重要条件。

5)动态剪切流变的测定。样品前处理同本文“1.3 2)”。将处理后的样品置于室温中稳定30 min后进行测定，设定温度25 ℃，采用直径为40 mm的平板，间隙为1 mm，应变设置为0.2%，将扫描频率设置为0.1～10 Hz，在此参数下对样品进行动态流变曲线的测定。

6)持水性的测定[5]。样品前处理同本文“1.3 2)”。将样品切成5 mm薄片，准确称量m1，用3层滤纸包好后将样品放入50 mL离心管中，在4 ℃条件下5 000 r/min离心15 min后取出，精确称质量m2。每组样品做4次平行试验。持水性的计算公式如下。

持水性=m2/m1×100%

(2)

式(2)中,m1为样品离心前质量；m2为样品离心后质量。

7) 凝胶水分分布状态分析[5]。样品前处理同本文“1.3 2)”。样品放置于室温下30 min后，制成高30 mm、直径10 mm的圆柱体放入核磁管，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间(T2)的测定。

参数设定：SW=100 kHz，SFI=22 MHz，P90=14 μs，τ=150 μs，TR=2 000 ms，Echocnt=4 000，NS=8。

8)打印效果。将样品放入打印机料斗，利用Host软件进行参数设定并进行打印。

1.4 数据分析

每个指标进行6组平行试验，利用SPSS 19.0软件进行数据分析处理，利用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 TG酶对金线鱼鱼糜浆料凝胶强度的影响

由图1可知，随TG酶添加量的增加，样品的凝胶强度和破断力呈先上升后下降的趋势，对于鱼糜凝胶的破断距离无显著性影响(P>0.05)；在TG酶添加量为0.2%时，凝胶强度最高为475.59 g·mm，较对照组凝胶强度(278.32 g·mm)提高了70.88%。

不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercases indicate significant differences (P<0.05).The same as below.

2.2 TG酶对金线鱼鱼糜浆料质构特性的影响

在3D打印中，材料本身的性质决定了样品的最终打印效果。如表1所示，随TG酶添加量的上升，鱼糜的硬度、胶着度、咀嚼度呈上升趋势；弹性、黏聚性随TG酶添加量的上升而逐渐增加，在TG酶添加量为0.2%时开始下降(P>0.05)。在TG酶添加量为0.4%时硬度最高，胶着度和咀嚼度在TG酶添加量为0时最低；弹性、黏聚性和浆料与凝胶强度的研究相符合(在TG酶添加量为0.2%时最高)，因为TG酶催化了蛋白内酰基的转移，使浆料内部的共价交联增强，促进了分子的聚集，提高了浆料的凝胶强度。随着TG酶添加量逐渐上升，浆料的固体性质越强，其原因是TG酶促进了蛋白质之间的交联，在TG酶添加量过高时，鱼糜内部的共价键饱合形成，网状结构更加紧致。

表1 TG酶添加量对金线鱼鱼糜质构特性的影响 Table 1 Effects of different additive of TGase on the texture of Nemipterus virgatus surimi

2.3 TG酶对金线鱼鱼糜浆料持水性的影响

由图2可知，浆料的持水性随着TG酶添加量的增加，呈先上升再下降的趋势，在TG酶添加量为0.2%时达到最高，相比于对照组提高了9.72%，表明添加一定量的TG酶可以改善浆料内部凝胶系统的持水性。

图2 不同TG酶添加量对金线鱼鱼糜持水性的影响

2.4 TG酶对金线鱼鱼糜浆料内部水分分布的影响

由图3和表2可以看出，TG酶对于浆料内部的T21单分子层水并无显著性影响，浆料的T22结合水含量均高于对照组，可能是由于TG酶促进浆料内部的大分子聚集体增多，与之结合的水分占比上升；T23不易流动水的占比呈先上升后下降的趋势，和本文“2.3”持水性的研究结果相符合，在TG酶添加量为0.2%时，T23不易流动水的占比为最高，相比于对照组提高了3.19%。

图3 不同TG酶添加量对金线鱼鱼糜弛豫时间的影响

表2 TG酶添加量对金线鱼鱼糜水分分布的影响 Table 2 Effects of different additive of TGase on the moisture distribution of Nemipterus virgatus surimi

2.5 TG酶对金线鱼鱼糜浆料表观黏度的影响

由图4可见，鱼糜浆料在恒定剪切速率的条件下，表观黏度随着TG酶添加量的上升而上升，在添加量为0.4%时达到最高。由表3可见,随着TG酶的添加量上升，鱼糜浆料的屈服应力显著增加。

图4 不同TG酶添加量对金线鱼鱼糜表观黏度的影响

2.6 TG酶对金线鱼鱼糜浆料流变特性的影响

由图5可见，鱼糜浆料的弹性模量(G′)均高于损耗模量(G″)，表明样品被施加一定剪切力后，其稳定性不会遭到破坏，有利于FDM3D打印中的样品沉积成型。随着TG酶添加量的上升，金线鱼鱼糜凝胶系统的弹性模量(G′)呈上升趋势，而损耗模量(G″)和损失正切(tanδ)先上升至TG酶添加量为0.2%时达到最高再下降。弹性模量(G′)表达了鱼糜浆料的弹性，如图5A所示,随着TG酶添加量的上升，鱼糜浆料的弹性越来越高；在3D打印过程中浆料的弹性越大，其流动性越差。而损耗模量(G″)表达了鱼糜浆料的黏性。如图5B所示，鱼糜浆料在添加TG酶后，损耗模量(G″)变大，且在TG酶添加量为0.2%时，样品的损耗模量(G″)最大。

如图5C所示，全部鱼糜浆料的损失正切(tanδ)小于1，表明浆料存在一定的刚性且具有类固体特征；而浆料损失正切(tanδ)的变化趋势与损耗模量(G″)的变化趋势一致，表明添加0.2%的TG酶有助于减小浆料内部的损耗模量，TG酶催化蛋白疏水基团的交联，提高了浆料的黏度，其损失正切(tanδ)较高说明浆料呈黏性特质且对浆料的流动性无不良影响。

表3 TG酶添加量对金线鱼鱼糜Herschel-Bulkley参数的影响 Table 3 Effects of different additive of TGase on the Herschel-Bulkley parameters of Nemipterus virgatus surimi

2.7 TG酶对金线鱼鱼糜浆料打印效果的分析

如图6所示，在TG酶添加量为0时，可以看出鱼糜丝在打印过程中有较多的断裂，样品的表面有多处凹陷，层与层之间的结合度较低，阶梯化现象较为严重。随着TG酶添加量的上升，鱼糜浆料的表观黏度和凝胶强度有所改善。样品表面的塌陷情况基本消失，阶梯化现象在TG酶添加量为0.3%和0.4%的样品中较为严重，与TG酶添加量为0.1%的相比，添加量为0.2%时表面的鱼糜丝相互之间契合度较高，表面更加完整光滑，打印复原模型的程度较高。综上，在TG酶添加量为0.2%时，3D打印效果最佳。

图5 不同TG酶添加量对金线鱼鱼糜流变特性的影响

图6 不同TG酶添加量对金线鱼鱼糜3D打印效果的影响

3 讨 论

3.1 TG酶对金线鱼鱼糜浆料凝胶强度的影响

在鱼糜3D打印的过程中，螺旋杆不断地旋转将物料向外挤压，而物料在被挤压的同时会因为螺杆旋转时产生的一系列剪切力发生剪切稀化，这种现象是指随着螺杆剪应率的不断升高，浆料的黏度逐渐减小，在此过程中鱼糜抵抗其他应力作用的平衡应力降低[6]，在此过程中，温度有所升高，可能会导致蛋白质变性，使得鱼糜与螺旋杆以及喷嘴之间的阻力增大，导致了鱼糜的流动性减弱，降低了打印的精度和效果。凝胶强度是衡量鱼糜品质的重要指标[7]。在3D打印过程中，鱼糜内部的肌球蛋白双螺旋解开，并发生交联形成一种网状结构(凝胶结构)；网状结构增加了鱼糜的体积，减少了鱼糜和螺旋杆和喷嘴之间的一系列剪切力。物料分子的聚集程度高可以减少剪切稀化对打印的影响[8-9]。因为鱼糜丝是通过自身重力和流体力学的作用在成型板上进行沉积成型，鱼糜内部凝胶结构的形成减少了鱼糜丝在成型过程中损耗的势能，因此，样品在沉积过程中不易发生塌陷[6]。样品凝胶强度随TG酶添加量变化的原因可能是由于鱼糜丝在打印过程中受热，蛋白质大分子热运动加剧，蛋白上的双螺旋结构延展开，并在TG酶的催化作用下蛋白质上的残基(如Gln残基和Lys残基)进行交联，从而提高了凝胶强度，这与Sakamoto等[10]的研究相符；而随着TG酶添加量的增大，凝胶强度开始下降，这是因为蛋白基团交联时所需要的共价键数目具有饱和性，当TG酶的含量过大时，过度的交联在一定程度上破坏了凝胶结构的稳定性，导致凝胶强度下降。

3.2 TG酶对金线鱼鱼糜浆料质构特性的影响

硬度表示鱼糜浆料在受到外力发生形变时对外力的抵抗能力[11]。在3D打印的过程中，物料的硬度越大，与螺旋杆和喷嘴之间的剪切力就越大，样品挤出的流畅性减小，剪切稀化的现象越严重，物料的黏度就越低。在TG酶添加量为0.4%时硬度最高，表明TG酶对于样品的硬度有升高的作用，其原因可能是TG酶促进了鱼糜内部的蛋白质共价交联，使鱼糜内部的大分子数量上升，这种大分子一般是由共价键相连的网状结构，同时在TG酶添加量增大时，鱼糜内部的共价键数量上升，鱼糜浆料内部的共价键数目增加使内部的大分子聚集趋于稳定，因此，物料的硬度上升[12]。在物料斗内鱼糜浆料被螺旋杆不断地施加剪切力，浆料的胶着度和咀嚼度越高，螺旋杆在螺旋挤压的过程中的阻力越大，造成机器的损耗和鱼糜浆料势能的损失也越大。样品的胶着度和咀嚼度在TG酶添加量为0时最低，其原因可能是鱼糜浆料内的蛋白质分子在进行斩拌后双螺旋被打开，使物料呈现出一种溶胶状态，在这种状态下的鱼糜浆料具有较好的流动性，其剪切应力和剪切应变率呈非线性关系[13]，而在添加TG酶后这些蛋白质残基被交联形成大的分子聚集体，浆料内的共价键增多增强了鱼糜的非牛顿流体特性，在斩拌机内剪切应力不断施加的过程中，浆料自身的势能损失下降，使胶着度和咀嚼性提高，浆料的黏性特质增强。如表1所示，弹性和黏聚性和浆料与凝胶强度的研究相符合(在TG酶添加量为0.2%时最高)，因为TG酶催化了蛋白内酰基的转移，使浆料内部的共价交联增强，促进了分子的聚集，提高了浆料的凝胶强度。随着TG酶添加量逐渐增大，浆料的固体性质越强，其原因是TG酶促进了蛋白之间的交联，在TG酶添加量过高时，鱼糜内部的共价键饱合形成，网状结构更加紧致。

3.3 TG酶对金线鱼鱼糜浆料持水性和水分分布的影响

持水性是指鱼糜凝胶在受到一定外力影响时，凝胶网络结构对水分束缚能力的大小[11]，是衡量浆料内部凝胶特性品质的重要物理指标之一。在3D打印过程中，适当提高浆料的凝胶强度可以有效减缓剪切稀化的现象，而凝胶网状结构的稳定性决定了浆料的沉积成型效果。浆料在打印时，蛋白在剪切力的影响下开始延展，内部的蛋白疏水基团暴露，凝胶内部的部分水分会被释放出来，降低了持水性，提高了浆料的损耗模量，导致浆料的非牛顿流体特性被影响，改变了浆料的剪应率线性关系，使浆料的黏度大大降低，不利于样品的成型。样品持水性随TG酶添加量变化的原因可能TG酶与二硫键之间的相互作用，可以催化氨基与γ-羧基酰胺之间的交联[14]，增强了凝胶结构对水的束缚力，同时使蛋白质网络结构更加紧凑，减少了被束缚的水分，提高了浆料的持水性。随着TG酶添加量的增大，在达到共价键饱合之后，蛋白网状结构更加致密紧凑，水分子不易进入凝胶系统，导致浆料的持水性开始下降。

样品内部水分分布随TG酶添加量变化的原因推测是，浆料内部有大量的肌原纤维蛋白，在蛋白表面有较多的极性亲水基团与水分相结合，在斩拌的过程中蛋白逐渐展开，更多的疏水基团暴露出来，一部分水分因为疏水基团的作用，逐渐在鱼糜内部游离，此时浆料呈现一种溶胶状态，伴随着TG酶添加量的上升，TG酶上的γ-酰胺基和肌原纤维蛋白上的赖氨酸残基(ε-氨基)，形成一种赖氨酸异肽键，促进蛋白质分子的交联，使蛋白质分子发生交联[15]。蛋白质分子交联后，一部分游离水被包裹住，使不易流动水的占比上升。而当TG酶的添加量大于0.2%时，T23的占比开始下降，分析其原因可能是，TG酶的添加量越大，其催化作用也越强，浆料内部的共价键也越多，导致了凝胶网络结构变得更加紧凑，无法填充更多的水分，使不易流动水的占比下降。随着TG酶添加量增大，T24游离水呈先下降后上升的趋势，与T23的变化趋势相反，这与Ahmad等[16]的研究相符，说明鱼糜内部一部分的游离水转化为不易流动水，同时游离水的占比过高，导致浆料的黏度下降，不利于3D打印的成型。

3.4 TG酶对金线鱼鱼糜浆料流变特性的影响

在3D打印中，由于螺旋杆和喷嘴对鱼糜浆料不断地施加剪切力，鱼糜内部的蛋白质分子会趋于向流动的方向逐渐延展开，此时由于蛋白被拉伸和延展，在这过程中浆料势能不断损失，影响了共价键的形成，使残基之间不易发生交联，所以鱼糜浆料的流动性增加，凝胶强度和黏度降低，不利于样品成型。表观黏度随TG酶添加量变化的原因可能是蛋白质双链在解旋之后，在TG酶催化的作用下，相互交联形成一种较为稳定的网状结构，这种结构之间的共价键较为稳定，在非酶的作用下不易断裂，所以增强了鱼糜浆料的表观黏度[17]，使鱼糜浆料的剪切稀化现象得到缓解，在进行剪切鱼糜时所需要的剪切应力增大。

随着TG酶的添加量增大，鱼糜浆料的屈服应力显著增加，推测其原因是蛋白在被施加剪切应力斩拌的过程中，被拉伸的蛋白上的疏水基团充分暴露，在TG酶的催化作用下促进了蛋白质分子之间的交联，使表观黏度上升，在恒定速率下剪切应力上升，浆料的固化性增强。随着TG酶添加量增大，浆料的流动性减弱，稠度上升，表明TG酶促进了浆料内部蛋白的交联共价键的数量上升，这种TG酶催化形成的共价键较为稳定，黏连性较强，降低了流动性，提高了黏度。

随着TG酶添加量的上升，鱼糜浆料的弹性性能越来越高，推测其原因是由于TG酶的催化作用使分子的聚集程度变强，使鱼糜浆料的共价键数量上升，提高了分子之间的稳定性，与Folk[18]的研究相符。

3.5 TG酶对金线鱼鱼糜浆料打印效果的分析

TG酶是一种特殊的酰基供体，通过自身的谷氨酰胺残基的γ-酰胺基与蛋白质中的赖氨酸残基结合，形成一种赖氨酸异肽键，促进了蛋白质的交联[4]，浆料内部形成了更多的凝胶网状结构，使金线鱼鱼糜丝在打印中不易发生断条的现象，减少了样品在沉积成型过程中的塌陷，大大提高了样品的精度。TG酶使浆料内部产生了更多的共价键，大分子聚集体之间的稳定性增强，浆料的黏度上升，使鱼糜丝的挤出更加舒畅。随着TG酶添加量增大，阶梯化现象在TG酶添加量为0.3%和0.4%的样品中较为严重，推测其原因可能是过高添加量的TG酶提高了鱼糜浆料的屈服应力，在屈服应力较大时不利于样品的挤出，导致样品沉积过程中阶梯化现象加剧[19]。与TG酶添加量0.1%的相比，添加量为0.2%时表面的鱼糜丝相互之间契合度较高，表面更加完整光滑，打印复原模型的程度较高。综上，在TG酶添加量为0.2%时，打印效果最佳。