碳氮比对SBR系统硝化过程及EPS三维荧光光谱特性的影响

陈翠忠，李俊峰，蓝明菊，额热艾汗，谢可飞，徐威龙，刘雅茹，孙洪伟

（1 石河子大学水利建筑工程学院，新疆石河子832000；2 烟台大学环境与材料工程学院，山东烟台264005）

胞外聚合物（extracellular polymeric substance,EPS）是活性污泥絮体的重要组成部分，占污泥总量的80%左右[1]，对污泥絮体的形成至关重要[2-3]。EPS主要由细微生物代谢、裂解以及吸附的无机和有机颗粒物质产生的高分子聚合物组成，目前学者认为EPS 主要由紧密型EPS（TB-EPS）和松散型EPS（LB-EPS）两部分组成[4]，主要组成包括多糖（polysaccharides, PS）、蛋白（proteins, PN）、核酸（DNA）和腐殖酸物质等[5]。反应器运行模式和微生物生长环境条件对EPS 产量和组分的影响显著，如碳源类型、碳氮比（C/N）、水力停留时间和毒性物质等[6]，其中C/N 是影响EPS 产量和组成的关键因素之一。Ye 等[7-8]研究认为增加有机碳含量可提高活性污泥的EPS 产量，Durmaz 等[9]认为C/N 为5 的活性污泥中EPS 具有较高的PN 含量和较低的PS含量，且随着C/N比的增加，PN含量急剧下降，PS 含量增加。Ye 等[6]研究表明，随着C/N 的增加，LB-EPS 中PN含量增加，PS含量下降，且TB-EPS中的PS 和PN 含量不受C/N 的影响。Miqueleto 等[8]研究发现在厌氧序批式生物膜反应器中，高C/N有利于EPS 的产生。此外，吴志高[10]研究表明，C/N与EPS 的组分（PS、PN 和DNA）含量呈正相关，其中C/N对PS的影响尤为明显。

大多数研究者采用寻峰法对荧光信息进行解析，但由于荧光峰通常是由若干相互叠加的荧光基团产生的信号，有些可能无法识别或识别不准确，且寻峰法只考虑三维光谱中的特定峰值，不能充分使用荧光指纹所携带的所有信息[11]。因此本文采用三维荧光光谱技术（three-dimensional fluorescence spectroscopy, 3D-EEM） 与荧光区域积分法（fluorescence region integral, FRI）的组合，在一定程度上能够克服以上不足，可用于表征有机物，其中包括废水中的EPS等[12-13]。Guo等[14]采用3D-EEM技术并结合FRI分析法评估了污泥水解过程中EPS和溶解有机物的组成特征，同时有学者基于双柱式交替缺氧/好氧相序批式反应器，采用FRI 分析认为区域Ⅳ（溶解性微生物代谢产物）是EPS的重要组分[15]。此外，Sun 等[16]利用3D-EEM 技术并结合FRI 分析法评估了不同热预处理温度下污泥中EPS的可生物降解和不可降解组分。

虽然许多学者已探究了C/N对活性污泥EPS的影响，但研究周期较短，缺乏3D-EEM技术对SBR系统进出水时EPS 特性的表征。因此，本文采用SBR 反应器，考察了4 种碳氮比（C/N 为0、5、10和15）条件下（运行281 天）不同碳氮比（C/N）条件下氨氮去除效果、C/N对硝化开始和硝化结束时活性污泥EPS 及其组分含量的影响、采用3DEEM联合FRI评估了不同C/N系统硝化开始和硝化结束时活性污泥EPS的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验装置及实验方案

SBR 反应器由有机玻璃制成，有效容积为5L，实验用水采用人工模拟污水，主要配水成分为99.9%的无水乙醇（300mg/L）、NH4Cl（20～60mg/L）和KH2PO4（6mg/L）和微量元素浓缩液[7]，每升废水加入1mL 微量元素。活性污泥取自甘肃兰州市污水处理厂曝气池。具体运行参数见表1。

接种污泥驯化20 天，然后分到4 个SBR 反应器中，每个反应器初始活性污泥浓度为3100mg/L。以化学需氧量（COD）与总氮（TN）的比值计算碳氮比（C/N），4个反应器的C/N 分别为0、5、10和15，分别以R0、R5、R10和R15代表，其中R0系统内的碳源浓度为0。

1.2 检测项目与方法

1.2.1 水质分析指标

1.2.2 EPS提取及其组分的测定

采用热处理法进行活性污泥EPS提取，详细提取步骤见参考文献[18]。提取出EPS 由松散型EPS（LB-EPS）和紧密型EPS（TB-EPS）两部分构成，再分别对其进行蛋白质（PN）、多糖（PS）和核酸（DNA）含量分析。PN采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白作为标准物质；PS采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准物质；DNA采用紫外吸收法[19]。故总EPS含量由可用式(1)计算。

表1 4个SBR反应器运行条件

1.2.3 3D-EEM联合FRI分析

荧光光谱采用荧光分光光度计（FP-6500，日本）测定。3D-EEM 以5nm 为增量从激发波长220nm 扫描到400nm，以1nm 为增量从发射波长250nm扫描到500nm，扫描速度为2000nm/min，响应时间为0.2s，采用Origin 9.0 对光谱图进行数据分析。为消除拉曼散射和瑞利散射的影响，在三维荧光数据解析前进行预处理[20]。Chen 等[21]提出FRI用于解析水体的三维荧光光谱图，FRI方法按照有机物的类型将三维荧光区域分为5个区域（表2）。

表2 荧光区的激发和发射（Ex/Em）波长

积分区域法计算某荧光区域的积分体积（Φi）、标准化体积（Φi,n，ΦT,n），表示这一区域的某一结构有机化合物含量的相对值，计算公式见式(2)～式(4)。

式中，Φi,n为荧光区域i的积分标准体积；Φi为荧光区域的积分体积，au·nm2；λex为激发波长，nm；λem为发射波长，nm；I(λexλem)为激发、发射波长对应的荧光强度，au；Pi,n为某一荧光区域的积分标准体积占总积分标准体积的比例；MFi为倍增系数，等于某一荧光区域的积分面积占总荧光区域积分面积比例的倒数。

2 结果与讨论

2.1 碳氮比对氨氮去除的影响

图1 4种C/N系统内氨氮去除效果

图2 4种C/N系统内氨氧化速率的变化规律

2.2 碳氮比对胞外聚合物的长期影响

图3 为SBR 系统在运行期间不同C/N 条件下进水（硝化开始，下同）和出水（硝化结束，下同）时EPS 含量的变化规律。如图3 和表3 所示，R5、R10和R15系统随着运行周期（第1～80 周期）的增加，进水[图3(a)]和出水时[图3(b)]的EPS 含量表现为递增的趋势，在第80 周期后无明显增量并在一定范围内波动，而C/N 条件为0时，进水和出水时的EPS含量在运行周期内并无明显变化，可以认为随着周期数的增加，R5、R10和R15系统运行趋于稳定，系统筛选得到较为稳定的微生物种类，则所产生的EPS 含量将无明显波动，而R0系统缺乏碳源，微生物活性较低，产生的EPS含量较低，则每周期的EPS 产量差异性较小。另外，随着C/N 值的升高，进水和出水时的EPS 含量均增大（进水：16.4mg/gSS→37.0mg/gSS→39.3mg/gSS→43.8mg/gSS；出 水 ： 18.0mg/gSS→40.7mg/gSS→43.3mg/gSS→48.9mg/gSS），可得R5、R10和R15系统内EPS含量分别是R0的2.2 倍、2.4 倍和2.7 倍，即高C/N 有利于提高EPS产量[7-8]，而Paulina等[26]以好氧颗粒污泥为研究对象[有机物负荷：0.78kgCOD/(m3·d)、1.16kg COD/(m3·d)和1.53kgCOD/(m3·d)]，发现低有机物负荷下EPS含量高于其他2种运行负荷，由于本文研究对象为活性污泥絮体EPS，而Paulina等[26]研究内容是好氧颗粒污泥EPS，两者研究对象存在一定的差异，同时由于好氧颗粒污泥去除有机物效率较高，在低有机负荷下，有机化合物的消耗时间较短，微生物则经历较长的饥饿期，导致好氧颗粒污泥分解，产生大量的EPS[27]，而高C/N 对活性污泥絮体EPS含量影响则更为显著。

图3 SBR反应器中EPS的变化规律

此外，由表3 可得，不同C/N 系统内出水EPS含量是进水时的1.09～1.12 倍，即EPS 在硝化过程有所积累，而孙洪伟等[28]研究发现硝化过程中EPS含量无明显变化，C/N为1.2～4.2。

表3 不同C/N条件下进出水时活性污泥EPS含量 单位：mg/gSS

2.3 碳氮比对多糖、蛋白及核酸含量的影响

如图4 和表4 所示，不同C/N 条件下，SBR 系统内进水[图4(a)]与出水[图4(b)]时EPS中PS，PN和DNA含量变化情况。升高C/N值（0→5→10→15），进水与出水时的PS、PN 和DNA 含量均随之增大。当C/N从0、5和10分别升高至5、10和15时，EPS中PS、PN 和DNA 含量分别增加约118%、1.5%和11%；171%、12%和28%；133%，28%和11%。结果表明，C/N 对EPS 的组分有显著影响，且C/N与PS、PN和DNA 含量呈正相关[10,29]，而Ye等[6,30]研究发现C/N对PS含量无影响。另一方面，当C/N从0升高至5，PS、PN和DNA含量变化幅度（118%～133%）明显高于C/N 从5 升高到15 时EPS 组分的变化（1.5%～28%），可得有机碳含量为不同碳氮比条件下EPS 组分变化的主导因素，在高C/N 条件下，微生物可利用多余的碳源进行细胞与PS 的合成[19]，同时氮用于微生物合成蛋白质和核酸，然而蛋白质和核酸的合成需要消耗能量[31]，因此高C/N促进微生物代谢产生PS、PN和DNA。同时，本文中PS 为EPS 重要组成部分（71%～80%），PN 次之（10%～18%），DNA 含量最低（9%～11%），与Yang等[3,32]研究结果一致，然而Paulina 等[27,33]认为PN 是EPS的重要组分。

图4 EPS组分含量变化规

此外，与进水时的EPS 组分比较，出水时的PN、DNA 含量以及DNA 所占百分比无明显变化（表4），而PN 所占百分比低于进水；同时硝化过程中PS 含量及其所占百分比均升高，由上可得硝化过程中PS 有明显积累，而PN 和DNA 含量无明显变化。

表4 EPS组分的含量及所占比例

2.4 EPS的FRI分析

基于3D-EMM技术，采用FRI分析方法计算可得样品总的荧光强度与不同区域荧光强度值[34-35]，本文通过FRI法分析得到不同C/N条件下硝化污泥EPS 的组分变化。图5 所示为不同C/N 系统活性污泥EPS的3D-EEM谱图，利用3D-EEM谱图可探究蛋白质类物质、富里酸和腐殖质等物质[36-37]，同时也可考察EPS 各组分物质被微生物利用的难易程度[38]。

基于3D-EEM谱图（图5），可得不同C/N条件下活性污泥系统进水和出水时的EPS荧光强度占比（Pi,n）（图6），EPS 各荧光区域Pi,n值分别为46%～57%（区域Ⅴ，腐殖酸类物质）、28%～41%（区域Ⅳ，溶解性微生物代谢产物）、6.5～13%（区域Ⅲ，富里酸类物质）、2%～4.5%（区域Ⅱ，蛋白质类物质色氨酸）和0.44%～1.9%（区域Ⅰ，蛋白质类物质酪氨酸），研究结果与Guo等[14]一致，而Wei等[15]认为溶解性微生物代谢产物（区域Ⅳ）为EPS重要的组成部分。同时4 种C/N 系统（C/N 为0、5、10和15）内进水EPS 的Pi,n值分别为区域Ⅰ（0.75%、1.86%、1.87%和1.39%）、区域Ⅱ（2.64%、4.4%、3.38%和3.21%）、区域Ⅲ（6.52%、7.53%、8.91%和12.79%）、区域Ⅳ（41.3%、39.2%、34.52%和36.4%）和区域Ⅴ（48.77%、46.98%、51.31%和46.18%）。由上可得，升高C/N（0→15），不同C/N条件下EPS 各荧光区域强度百分比存在显著差异，其中R0系统内EPS 区域Ⅰ荧光强度明显低于其他C/N系统，且区域Ⅲ荧光区域强度与C/N呈正相关，以及区域Ⅳ荧光区域强度随C/N的升高而减小，可见C/N对活性污泥EPS的荧光物质影响显著。

图5 进出水时EPS三维荧光光谱图

图6 进出水时EPS荧光区域标准积分体积组成

如表5 所示，硝化过程中不同C/N 系统区域Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ荧光区域的积分标准体积表现为递减的趋势，而区域Ⅲ和Ⅳ积分标准体积值增大，同时各区域硝化过程荧光强度占比变化（出水Pi,n-进水Pi,n）分别为区域Ⅰ（-0.31%、-0.19%、-1.16%和-0.49%）、区域Ⅱ（-0.54%、-1.03%、-1.34%和- 0.38%）、 区 域Ⅲ（5.2%、 0.64%、 3.06% 和0.19%）、区域Ⅳ（-9.12%、-1.36%、-6.49%和-4.15%） 和区域Ⅴ（4.77%、1.94%、5.93% 和4.83%）。由以上可得不同C/N条件下SBR系统硝化过程中区域Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的荧光强度均有不同程度减弱，而区域Ⅲ和Ⅴ的荧光强度增强，即蛋白质类物质酪氨酸和色氨酸以及溶解性微生物代谢产物在硝化过程中被微生物所利用，其中溶解性微生物代谢产物被微生物利用率较高（1.36%～9.12%），而富里酸和腐殖酸类物质在硝化过程中不易被微生物利用[39]，同时有学者研究认为腐殖酸的积累不利于污泥的进一步利用[14]。

表5 进出水时EPS荧光区域的积分标准体积

3 结论

（2）随着C/N值的升高，SBR系统进水和出水时的EPS及其组分含量均随之增大，其中C/N对PS含量影响尤为显著。且硝化过程中PS有明显积累。

（3）活性污泥EPS 荧光区域Ⅴ（腐殖酸类物质，46%～57%）的Pi,n值最高，区域Ⅰ（蛋白质类物质酪氨酸，0.44%～1.9%）Pi,n值最低，且不同C/N条件下EPS各荧光区域强度百分比存在显著差异，以及蛋白质类物质酪氨酸和色氨酸及溶解性微生物代谢产物在硝化过程中被微生物所利用，其中溶解性微生物代谢产物被微生物利用率较高（1.36%～9.12%）。