硫酸新霉素废水活性污泥的微生物群落结构解析

董 浩，吕育财，任立伟，龚大春，沈联兵

(1.三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所，湖北 宜昌 443002；3.宜昌三峡制药有限公司，湖北 宜昌 443002)

硫酸新霉素生产废水是一类有机污染物浓度高、水质复杂、处理难度大的工业废水，直接排放会造成非常严重的水体污染，尤其是废水中残留的硫酸新霉素及副产品会对环境及人体造成不可挽回的影响，亟需研发经济有效的硫酸新霉素废水处理技术[1-2]。目前，硫酸新霉素等抗生素类废水的处理主要采用活性污泥A/O法[3]，该法通过硝化和反硝化作用能有效去除废水中大量的COD和NH3-N。近年来，随着生物技术的发展，废水处理工艺不断改进，对废水活性污泥微生物群落结构的分析也成为研究热点。彭永臻等[4]对不同地方污水处理厂不同来源的活性污泥进行了宏基因组测序，得到了活性污泥微生物群落的结构组成及优势菌群数据；还有研究者采用16S rDNA测序方法快速鉴定废水处理系统中的目标细菌[5]、对活性污泥胞外聚合物中的蛋白质进行定量分析[6]、通过驯化分离筛选更高效的硝化与反硝化细菌[7-10]，从而提高活性污泥A/O法对硫酸新霉素废水中COD和NH3-N的处理效率[11-12]。但硫酸新霉素废水活性污泥中富集了大量的好氧及厌氧微生物，这些微生物通过生长代谢及相互作用形成了复杂的微生物群落[13]。因此，分析活性污泥微生物群落结构对硫酸新霉素废水处理具有至关重要的作用。

作者以硫酸新霉素废水处理中的好氧、厌氧活性污泥为研究对象，采用16S V3-V4扩增区域的微生物分类测序方法，对2种活性污泥中的微生物群落结构和差异物种进行分析，探寻2种活性污泥中的优势菌群以及硫酸新霉素废水处理系统中的目标细菌，为硫酸新霉素废水处理提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

好氧活性污泥(原始样品编号：200628)和厌氧活性污泥(原始样品编号：200701)，从硫酸新霉素废水处理厂采集后分别放入灭菌2 mL样品管中，常温保存。

土壤DNA处理工具包，OMEGA；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒，Life；PCR反应混合液、DNA选择珠子，Yeasen；所用试剂均为国产分析纯。

Pico-21型台式离心机，Thermo Fisher；GL-88B型漩涡混合器，海门其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H混匀型干式恒温器，深圳拓能达科技有限公司；DY-Ⅲ型电泳仪，北京六一仪器厂；FR-1000型凝胶成像系统，上海复日科技有限公司；Q32866型荧光计，Invitrogen；ETC 811型 PCR扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；0.5～10 μL移液器，Eppendorf。

1.2 样本DNA的提取

2 mL离心管中加入0.8 mL活性污泥，振荡5 min使其混匀；加入80 μL DS缓冲液，振荡混匀，70 ℃恒温金属浴裂解10 min；室温13 000 r·min-1离心5 min；吸取600 μL上清液于新的2 mL离心管中，加入200 μL SP2缓冲液，振荡混匀；加入100 μL HTR试剂，振荡10 s使其混匀，冰浴5 min；室温13 000 r·min-1离心5 min；吸取400 μL上清液于新的2 mL离心管中，加入450 μL固定缓冲液和40 μL Magsi粒子，振荡混匀，室温静置2 min；置于磁力架上吸附5 min，小心吸弃上清液；加入500 μL固定缓冲液，振荡混匀，室温静置2 min；小心吸弃上清液，加入1 000 μL PHB缓冲液，振荡混匀，置于磁力架上吸附5 min，弃上清液；加入1 000 μL SPM清洗缓冲液，振荡混匀，置于磁力架上吸附5 min，弃上清液，重复该步骤；置于55 ℃烘箱中烘10 min，使残留酒精完全挥发；加入60 μL洗脱缓冲液，充分振荡混匀，65 ℃金属浴10 min；置于磁力架上吸附5 min，小心吸取上清液于新的1.5 mL离心管中，即得样本DNA。

采用琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA完整性；采用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒定量检测样本DNA浓度，分别为120 ng·μL-1(好氧活性污泥样本200628)、21.8 ng·μL-1(厌氧活性污泥样本200701)。

1.3 PCR扩增与测序

PCR引物合成和DNA测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。正向引物Nobar_341F为5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物Nobar_805R为5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。

PCR第一轮扩增：将PCR管置于PCR仪中进行扩增，PCR反应条件为：94 ℃，3 min→→(94 ℃，30 s→45 ℃，20 s→65 ℃，30 s)5→→(94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s)20→→72 ℃，5 min→→10 ℃，∞。

PCR第二轮扩增：将PCR管置于PCR仪中进行扩增，PCR反应条件为：95 ℃，3 min→→(94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s)5→→72 ℃，5 min→→10 ℃，∞。

采用Miseq测序方法对样本DNA进行测序。

1.4 数据分析

采用RDP 16S数据库、Silva 16S数据库及NCBI 16S数据库对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 好氧、厌氧活性污泥中的微生物群落结构分析

对好氧活性污泥样本200628与厌氧活性污泥样本200701的微生物群落结构进行分析，门水平的相对丰度如图1所示，属水平的相对丰度如图2所示。

图1 活性污泥中的微生物门水平相对丰度柱状图Fig.1 Relative abundance histogram of microorganisms in activated sludge at phylum level

图2 活性污泥中的微生物属水平相对丰度柱状图Fig.2 Relative abundance histogram of microorganisms in activated sludge at genus level

由图1可知，从门水平而言，好氧活性污泥中的微生物类型主要为变形菌门(Proteobacteria，34.3%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，11.5%)，2类微生物合计45.8%，变形菌门微生物的相对丰度约为拟杆菌门微生物的3倍；厌氧活性污泥中的微生物类型主要为厚壁菌门(Firmicutes，42.7%)、拟杆菌门(15.5%)和变形菌门(10.7%)，3类微生物合计68.9%。2种活性污泥均含有较多的变形菌门和拟杆菌门微生物。

由图2可知，从属水平而言，好氧活性污泥中相对丰度最高的微生物为Parcubacteria_genera_incertae_sedis(2.9%)，但其在厌氧活性污泥中的相对丰度极低(<0.1%)，其次为硝化螺菌属(Nitrospira，1.9%)和Aquihabitans(1.9%)；厌氧活性污泥中相对丰度最高的微生物为芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)，芽孢八叠球菌属的代表为脲芽孢八叠球菌，但该菌在硫酸新霉素废水处理体系中未检测到，其次为甲烷丝菌属(Methanothrix，4.2%)、泰氏菌属(Tissierella，3.8%)、嗜碱菌属(Alkaliphilus，3.7%)、副球菌属(Paracoccus，3.2%)、Pusillimonas(2.3%)、Petrimonas(2.3%)和Pelolinea(2.1%)。

2.2 好氧、厌氧活性污泥中的高丰度微生物在废水处理过程中的代谢功能预测

为了研究硫酸新霉素废水处理过程中的代谢产物与活性污泥中高丰度微生物的相关性，采用PICRUST(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)预测活性污泥样本200628和200701中高丰度微生物在废水处理过程中的代谢功能相对丰度，结果见表1。

表1 活性污泥中高丰度微生物的预测代谢功能相对丰度/%

由表1可知，好氧活性污泥样本200628中相对丰度较高的3个属(Parcubacteria_genera_incertae_sedis、Nitrospira、Aquihabitans)与硝化作用(nitrification)、有氧亚硝酸盐氧化(aerobic nitrite oxidation)、甲基营养(methylotrophy)和甲烷营养(methanotrophy)等4种功能密切相关，其中硝化作用相对丰度最高(34.41%)；厌氧活性污泥样本200701中相对丰度较高的8个属(Sporosarcina、Methanothrix、Tissierella、Alkaliphilus、Paracoccus、Pusillimonas、Petrimonas、Pelolinea)与产甲烷(methanogenesis)、甲基营养、甲醇氧化(methanol oxidation)、氢营养型甲烷化(hydrogenotrophic methanogenesis)、通过CO2和H2的还原产生甲烷(methanogenesis by CO2reduction with H2)、通过H2还原甲基生成甲烷(methanogenesis by reduction of methyl compounds with H2)等6种功能密切相关，其中产甲烷相对丰度最高(36.33%)。因此，推测好氧活性污泥中3个高丰度微生物的主要功能为硝化作用，厌氧活性污泥中8个高丰度微生物的主要功能为产甲烷。

2.3 好氧、厌氧活性污泥中的微生物群落主要差异物种的分析与其主体菌属的判定

为进一步分析好氧、厌氧活性污泥中的微生物群落结构与废水处理功能的关系，对2种活性污泥样本200628、200701中的微生物群落主要差异物种分别进行分析，结果如图3所示。

由图3可知，好氧活性污泥中相对丰度最高的变形菌门可能存在3种变形菌属(Alphaproteobacteriaα-变形菌，4.55%、Gammaproteobacteria丙型变形菌，7.43%、Betaproteobacteriaβ-变形菌，19.19%)，而厌氧活性污泥中相对丰度最高的厚壁菌门可能存在2种厚壁菌属(Bacilli芽孢杆菌，16.56%、Clostridia梭菌，23.71%)。

将3种变形菌属、2种厚壁菌属的代表操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)进行比较，同时将各OTU的相对丰度进行标注，结果如图4所示。

由图4可知，好氧活性污泥中丙型变形菌代表OTU34的相对丰度为2.20%、β-变形菌代表OTU195和OTU89的相对丰度分别为1.08%和1.23%；厌氧活性污泥中芽孢杆菌代表OTU4和OTU175的相对丰度分别为8.24%和1.23%、梭菌代表OTU8、OTU26和OTU16的相对丰度分别为3.03%、1.13%和1.85%。根据OTU分类学信息表，好氧活性污泥中OTU34为Xanthomonadaceae黄单胞菌属，OTU195和OTU89均为Rhodocyclaceae红环菌属；厌氧活性污泥中OTU4为Planococcaceae动性球菌属，OTU175为Bacillus芽孢杆菌属，OTU8为Alkaliphilus嗜碱菌属，OTU26和OTU16均为Tissierella泰氏菌属。上述代表OTU在好氧活性污泥中的相对丰度分别为：OTU34，2.20%、OTU195，1.08%、OTU89，1.23%、OTU4，0、OTU175，0.32%、OTU8，0.0065%、OTU26，0.0065%、OTU16，0.013%；在厌氧活性污泥中的相对丰度分别为：OTU34，0.0097%、OTU195，0、OTU89，0.19%、OTU4，8.24%、OTU175，1.23%、OTU8，3.03%、OTU26，1.13%、OTU16，1.85%。

图4 2种活性污泥中的微生物群落分类学系统树状图(带有OTU标示)Fig.4 Tree diagram of taxonomic systems of microbial community structure in two kinds of activated sludge(with OTU marking)

通过比较分析好氧活性污泥中变形菌属及厌氧活性污泥中厚壁菌属的代表OTU，可以得出以下结论：(1)在好氧活性污泥中，OTU4的相对丰度为0，OTU8、OTU26、OTU16的相对丰度几乎为0，说明未投入使用的好氧活性污泥中没有动性球菌，几乎没有嗜碱菌和泰氏菌；OTU34的相对丰度最高，说明未投入使用的好氧活性污泥中相对丰度最高的变形菌属为黄单胞菌，其次是红环菌；(2)在厌氧活性污泥中，OTU195的相对丰度为0，但OTU89的相对丰度却达0.19%，说明未投入使用的厌氧活性污泥中存在红环菌；OTU34的相对丰度几乎为0，说明未投入使用的厌氧活性污泥中几乎没有黄单胞菌；OTU4的相对丰度最高，说明未投入使用的厌氧活性污泥中相对丰度最高的厚壁菌属为动性球菌，其次相对丰度由高到低分别为嗜碱菌和泰氏菌；(3)2种活性污泥中OTU89、OTU175均有一定的相对丰度值，说明2种未投入使用的活性污泥中均存在一定数量红环菌和芽孢杆菌。

3 结论

(1)采用宏基因组技术对好氧、厌氧活性污泥进行微生物分类测序，发现活性污泥中的微生物群落组成超过20个属(不包括未分类的属)，能满足硫酸新霉素废水处理的性能要求。

(2)从门水平分析来看，变形菌门和拟杆菌门是好氧活性污泥中的主体菌门，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是厌氧活性污泥中的主体菌门，活性污泥中都含有较多的变形菌门和拟杆菌门；从属水平分析来看，未投入使用的好氧活性污泥中高丰度菌属的排序为：Parcubacteria_genera_incertae_sedis>硝化螺菌属(Nitrospira，大致与Aquihabitans相当)，而未投入使用的厌氧活性污泥中高丰度菌属的排序为：芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)>甲烷丝菌属(Methanothrix)>泰氏菌属(Tissierella)>嗜碱菌属(Alkaliphius)>副球菌属(Paracoccus)>Pusillimonas(大致与Petrimonas相当)>Pelolinea。

(3)结合高丰度微生物代谢功能预测的数据，推测好氧活性污泥中高丰度微生物的主要功能为硝化作用，厌氧活性污泥中高丰度微生物的主要功能为产甲烷；通过2种活性污泥微生物群落的主要差异物种的分析，发现好氧活性污泥中变形菌门可能存在3种变形菌属，分别是α-变形菌、丙型变形菌、β-变形菌，而厌氧活性污泥中厚壁菌门可能存在2种厚壁菌属，分别是芽孢杆菌、梭菌；对其中的主体菌属进行判定，好氧活性污泥中相对丰度最高的变形菌属为黄单胞菌，而厌氧活性污泥中相对丰度最高的厚壁菌属为动性球菌。

(4)该研究发现的活性污泥优势菌群，将对硫酸新霉素废水处理系统中的目标细菌调控具有重要指导意义，也将为优化活性污泥A/O法处理硫酸新霉素废水的工艺提供重要的参考数据。