原酸和铁冬青酸在铁冬青种子沙藏前后的变化及其作用

林庆华

（福建省武平南坊国有林场，福建龙岩 364300）

铁冬青（ILex rotunda），别名救必应[1-2]。常绿乔木，枝繁叶茂，四季常青；10～12月，果熟时红若丹珠，赏心悦目，是理想的园林观果树种。目前，铁冬青尚无组培扩繁成功的报道，扦插繁殖难度大，主要采用种子繁殖的方式进行扩繁育苗，种子因休眠需隔年才能萌发。为探索解除铁冬青种子休眠的措施，通过HPLC检测，铁冬青种子中含有绿原酸和铁冬青酸，且湿沙层积沙藏1年后，绿原酸和铁冬青酸有不同程度的减少。通过铁冬青酸标准品胁迫白菜种子发芽试验，结果表明铁冬青酸会抑制白菜种发芽，熊愈辉、孙佳等已报道绿原酸是植物种子发芽抑制物[3-4]，所以，湿沙层积沙藏是解除铁冬青种子休眠的一种手段。

1 试验仪器材料

1.1 种子

1.1.1 铁冬青种子。2014年，龙岩市新罗区鑫林苗圃在新罗、永定、上杭、武平、连城5县（区）开展铁冬青优树选择工作所选定的10号优树的种子千粒重为3.982g。2014年的种子自然风干后，经过湿沙层积沙藏1年；2015年的种子自然风干后，室温贮藏。

1.1.2 白菜种子。‘苏州青’白菜种子，购自梅州市三农种业发展有限公司，产自辽宁。纯度≥96.0%，净度≥98.0%，发芽率≥96.0%，水分≤7.0%。

1.2 试剂

HPLC检测所用的绿原酸、铁冬青酸的对照品均产自中国药品生物制品检定所，纯度在98.0%以上，水为超纯水。

绿原酸检测：乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。铁冬青酸检测：乙腈、三氟乙酸为色谱纯，甲醇为分析纯。

胁迫试验：铁冬青酸标准品的溶剂为95%乙醇，稀释水为蒸馏水。

1.3 仪器

AgiLent-1260高效液相色谱仪（真空在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱,DAD检测器，Chemstation化学工作站），超声仪，万分之一电子天平，超声清洗器。

2 试验方法

2.1 HPLC检测

2016年4月，在闽西职业技术学院环境检测中心实验室完成。

2.1.1 色谱条件。色谱柱PhenomenesC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温30℃。

2.1.2 样品溶液的制备。将铁冬青种子磨粉过60目筛，精确称取0.200g样品细粉，置于100mL锥形瓶中，加入70%甲醇40mL，室温下超声30min，取出放冷后过滤，重复提取3次，合并滤液并用70%甲醇定容于100mL量瓶中，用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。平行制备3份。

2.2 绿原酸检测

2.2.1 流动相。乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87），流速1.0m/min，检测波长327nm。

2.2.2 对照品溶液的配制。精确称取绿原酸对照品适量，加70%甲醇溶液制成含绿原酸25μg/mL的溶液，超声溶解，即得。

2.2.3 标准曲线制备。将绿原酸对照品溶液用自动进样器依次进样1、3、5、7、9uL，仪器输出绿原酸对照品溶液标准曲线。

2.2.4 检测。用自动进样器将各样品溶液进样50μL，测定峰面积，对照绿原酸对照品溶液标准曲线，仪器输出样品中绿原酸的含量。平行检测3次，3次平行检测结果的平均值即为铁冬青种子中绿原酸的含量。

2.3 铁冬青酸检测

2.3.1 流动相。乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液（55∶45），检测波长：250nm。

2.3.2 对照品溶液的制备。精确称取铁冬青酸对照品0.200g，加70%甲醇溶液制成含铁冬青酸的100μg/mL溶液，超声溶解，摇匀，备用。

2.3.3 标准曲线制备。将铁冬青酸对照品溶液用自动进样器分别进样10、30、50、70、90uL，仪器输出铁冬青酸对照品溶液标准曲线。

2.3.4 检测。用自动进样器将各样品溶液进样25μL，测定峰面积，对照铁冬青酸对照品溶液标准曲线，仪器输出样品中铁冬青酸的含量。平行检测3次，3次平行检测结果的平均值即为铁冬青种子中铁冬青酸的含量。

2.4 胁迫试验

铁冬青酸标准品胁迫白菜种子发芽试验，2016年3月在龙岩市林木种苗质量检测中心完成。

2.4.1 试液配制。将铁冬青酸标准品用95%乙醇溶解，再用蒸馏水稀释配制为2.0mg/L、1.25mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.125mg/L的溶液。再备1份清水作对照用。

2.4.2 种子处理。分捡饱满、粒较大的白菜种子13份，100粒/份；将分捡好的白菜种子分别置于上述溶液中浸泡6h。用细湿沙铺沙床，然后将浸泡过的白菜种子均匀地置于沙床上，最后用细湿沙薄盖苗床，以保湿。将苗床置于平均温度20℃、平均湿度65%的人工智能气候室中。

2.4.3 种子发芽计量。2d后，幼苗开始出土，开始计算幼苗数量，直至连续5d无新幼苗出土为止。平行试验3次，3次平行试验结果的平均值即为白菜种子的发芽率。

2.4.4 数据处理。铁冬青酸胁迫白菜种子发芽试验数据，采用SAS 8.2软件进行方差分析分析和多重比较分析[5]。

3 结果与分析

3.1 结果

3.1.1 HPLC检测结果。经计算，没经过湿沙层积沙藏的铁冬青种子中绿原酸含量为596.40μg/g、铁冬青酸含量为17.02μg/g；湿沙层积沙藏1年后，铁冬青种子中绿原酸含量为127.40μg/g、铁冬青酸含量为14.32μg/g。

3.1.2 胁迫试验结果。清水处理（CK）的白菜种子发芽率为67.5%。铁冬青酸胁迫白菜种子的出苗影响较大，当铁冬青酸浓度达到1.0mg/L以上时，白菜种子的出苗率为0；铁冬青酸浓度为0.125～0.5mg/L时，白菜种子有发芽，但与清水处理（CK）相比，白菜种子的发芽率下降（表1）。

表1 不同浓度铁冬青酸处理后白菜种子的发芽率

3.2 分析

经过对HPLC检测结果分析，湿沙层积沙藏1年后，铁冬青种子的绿原酸含量减少78.6%、铁冬青酸含量减少15.9%。

方差分析表明，不同浓度铁冬青酸处理白菜种子，发芽率呈极显著差异（p=0.0003）。

多重比较分析表明，清水处理（CK）与试验处理1、2、3、4、的白菜种子的发芽率有极显著差异，与处理5、6的白菜种子的发芽率无显著差异；处理5、6与1、2、3、4的白菜种子的发芽率有极显著差异；其它处理之间的白菜种子的发芽率无显著差异（表2）。

表2 不同浓度铁冬青酸处理后白菜种子发芽率的多重比较分析

4 结论与讨论

4.1 结论

铁冬青种子含有绿原酸和铁冬青酸，且2种化合物都是植物种子发芽抑制物。湿沙层积沙藏可以减少铁冬青种子中绿原酸和铁冬青酸的含量，1年后，绿原酸含量减少78.6%、铁冬青酸含量减少15.9%。铁冬青酸对白菜种子的发芽抑制作用显著，当铁冬青酸浓度达到1.0mg/L以上时，对白菜种子的发芽起完全抑制作用；当铁冬青酸浓度为0.5mg/L时，对白菜种子的发芽有显著抑制作用；当铁冬青酸浓度为0.125～0.2mg/L时，对白菜种子的发芽无显著影响。

4.2 讨论

①铁冬青种子如果不经过催芽处理，当年播种是不会萌发的，经过湿沙层积沙藏1年后，绿原酸和铁冬青酸的含量会减少，种子也会发芽；种子含较高浓度的绿原酸和铁冬青酸是导致铁冬青种子休眠的原因之一。②湿沙层积沙藏1年后，铁冬青种子能够发芽，且绿原酸和铁冬青酸的含量也会减少，所以，湿沙层积沙藏可以解除铁冬青种子的休眠。③铁冬青种子是否含有其它发芽抑制物，有待进一步检测，种子发芽抑制是种子内源物之间互相影响的结果[3-4]。