单糖定性定量的色谱分析方法的研究进展

尹大芳,孙晓杰,郭莹莹,彭吉星,王婧媛,李 娜,王联珠,*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

多糖的生理活性越来越受到关注,已被发现在降血脂[1]、抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗病毒[4]、抗贫血[5]和神经保护作用[6]等方面具有显著功效[7]。多糖可分为同多糖和杂多糖,自然界存在的多糖通常为杂多糖,由多种单糖聚合而成。单糖组成对多糖生物活性具有重要影响,单糖组成是评价多糖理化性质的第一步,是糖类研究必不可少的一个环节。单糖极性大、无紫外和荧光特性,种类多样,结构相似,具有同分异构体;因此,多糖中单糖分离及定量分析极具挑战,成为制约糖类生物活性及应用研究的瓶颈[8]。

表1 无需衍生化的检测器的优缺点

早期,单糖的定量测定方法有容量法、旋光法和比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚法)等,该类方法缺乏专属性,仅能用于总糖量的测定[9]。随后,纸层析法和薄层色谱法应用到单糖的定性定量检测,该类色谱法只能实现单糖的半定量分析,灵敏度和分离度差,只适用于单糖组成相对简单的多糖的定性分析[10]。近年来,上述方法已逐步被高效液相色谱法、气相色谱法、高效阴离子色谱法和毛细管电泳法等方法所取代,极大提高了单糖定性定量分析方法的准确性。高效液相色谱仪在实验室较为普及,因此,高效液相色谱法应用最为广泛。气相色谱法的局限之处在于单糖的检测需要衍生化处理,使其具有足够的挥发性,衍生化过程操作繁琐[11]。毛细管电泳和高效阴离子色谱法为单糖的高效分离提供了强有力的工具,在单糖的定性定量分析中极具发展潜力。

本文针对单糖的分离和定性定量的常用分析方法(液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法和高效阴离子交换色谱法)进行文献综述以及分析评述,以期为多糖中单糖组成的检测技术的建立提供理论参考。

1 高效液相色谱

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是利用混合物内各组分特定的理化性质(极性、相对分子质量等)在两相(流动相和固定相)之间分配系数的差别,从而使各组份得到分离,传送到检测器进行检测。HPLC耦合的检测器根据是否需要对单糖进行衍生化可分为两种,即需衍生化的检测器和无需衍生化的检测器。

1.1 无需衍生化的检测器

无需对单糖衍生化便可直接检测的检测器有示差折光检测器(refractive index detector,RID)、蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,ELSD)、荷电气溶胶检测器(charged aerosol detection,CAD)以及质谱检测器(mass spectrometer,MS);此种检测器不需要柱前柱后衍生便可完成单糖的检测,具有操作简便,节省时间等优点。表1为HPLC常用无需衍生化检测器的优缺点。

1.1.1 色谱柱类型及特点 由于糖类具有亲水性,未衍生的糖类不可通过普通反相色谱柱实现对单糖的分离[15]。目前,应用于未衍生-HPLC的分离常用色谱柱有:糖基柱、氨基柱、酰胺柱。该类色谱柱柱稳定性、寿命以及分离重现性等方面不佳[12]。其中,酰胺柱比氨基柱的稳定性更高,寿命更长;酰胺柱的梯度兼容性更高,能够排除盐分的干扰,减少溶剂消耗而被广泛应用[16]。

1.1.2 示差折光检测器 HPLC-RID操作简便、快速,应用较为广泛,《食品安全国家标准 蜂蜜》[17]和《中国药典》[18]均采用HPLC-RID测定蜂蜜中的单糖和二糖,《中国药典》中许多单糖的测定也采用该法。Filip等[19]利用HPLC-RID经Carbosep Coregel 87H3 column色谱柱对苹果的叶片和苹果皮中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨糖等4种糖类化合物进行分离检测,其线性关系良好(R2>0.99),检出限为2.67～4.83 mg/L,定量限为8.9～16.1 mg/L,RSD<5.05%,回收率为93.94%～103.06%。RID的检出限高,灵敏度低;受温度影响大,需保持恒温,微小的温度波动也会引起响应值的巨大波动[15]。RID与流动相浓度的波动紧密相关,使用梯度洗脱时会发生基线漂移,影响单糖定量的准确度[20]。RID作为检测器时,不可使用梯度洗脱,而单糖分离过程中,等度洗脱很难将复杂的单糖混合物进行分离,使单糖分离效果受到限制。

1.1.3 蒸发光散射检测器 HPLC-ELSD对温度波动不敏感[21],逆梯度洗脱可使ELSD响应值不受洗脱剂梯度影响,ELSD可使用梯度洗脱[8]。HPLC-ELSD通过对洗脱剂蒸发,从而达到对不易挥发的物质进行检测的方法,需要洗脱剂具有较低的沸点,以使洗脱剂容易蒸发,防止糖类的热降解[21-22]。Ma等[23]对桃子、苹果、西瓜和樱桃等4种水果研磨取汁过滤膜后,直接进样,利用HPLC-ELSD经氨基柱分离对果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖4种糖类进行检测,在1～3000 mg/L线性范围内，决定系数R2为0.9934～0.9978,检出限和定量限分别为0.07～0.27 mg/L和0.22～0.91 mg/L,方法回收率为96.05%～103.32%。吴晓鹏等[24]利用HPLC-ELSD经Xbridge-NH2色谱柱分离测定木薯中的果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖,检出限为4.00～7.00 mg/L,灵敏度相对较低。ELSD的局限之处在于检测灵敏度相对较低,对于相对分子质量较小的物质线性关系较差。

1.1.4 荷电气溶胶检测器 CAD又称为电雾式检测器,是以粒子的质量为基准,具有普遍适用性。相对于RID和ELSD,具有更高的检测灵敏度及更低的检出限。Yan等[25]利用HPLC-CAD经BEH amide column分离检测植物中的鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等8种单糖,该方法线性关系良好(R2≥0.9981),回收率为94.02%～103.37%,检出限为15～40 ng。相比于RI和ELSD,CAD在灵敏度、线性关系、重复性和方法回收率等方面表现更佳。

表2 需衍生化检测器的优缺点

1.1.5 质谱检测器 MS具有快速、高效、准确的特点,在单糖结构解析方面具有独一无二的优势,是未来糖类结构解析技术的发展方向。赵丹等[26]采用HPLC-MS经Waters Acquity BEH Amide色谱柱测定螺旋藻多糖的单糖组成,鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等12种单糖的定量限在0.005～0.15 mg/L之间,回收率在80.21%～121.6%之间。王倩文等[27]利用HPLC-MS测定啤酒中果糖、葡萄糖的含量,果糖检出限为0.05 mg/L,葡萄糖检出限为0.49 mg/L,决定系数R2=0.9999。Wu等[28]采用PMP-HPLC/ESI-MS对食用马尾藻多糖中单糖进行了分析,实现了对甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖五种单糖的快速、准确、经济的分离检测,线性范围在0.1～10 mg/L之间,检出限在0.02 mg/L及以下。该方法样品前处理简单,准确度高,检测灵敏度高,复现性高。但一些利用HPLC-MS检测糖类的文献中缺乏关于回收率的方法学验证数据,这可能是由于HPLC-MS的回收率较低。MS的局限之处在于单糖自身低电离度造成检测的灵敏度低,复现性差,回收率差;另外,MS设备价格昂贵,操作技术要求高,需要熟练的分析人员,现阶段应用推广还较为困难。

1.2 需衍生化的检测器

常用的需衍生化的检测器有:紫外检测器(ultra-violet detector,UV)和荧光检测器(fluorescence detectors,FLD)。该检测器通常具有准确可靠、灵敏度高的优点,但也伴随着操作繁琐,浪费时间的不足。表2为HPLC常用需衍生化检测器的优缺点。

1.2.1 衍生化 糖类化合物缺乏发色团和荧光团(无紫外和荧光特性),单糖只吸附在190～210 nm区域,而HPLC常用的乙腈等有机流动相在此区域的吸附也较强,不能直接利用UV和FLD等对单糖进行检测,需要对单糖进行衍生化使其具有更高的检测灵敏度和更好地淋洗液梯度兼容性[8]。大部分糖类物质呈现电中性、亲水性,衍生化可使其变为带电荷的、易电离的、疏水性强的衍生物,增加检测器对其的检测灵敏度[30]。例如:中性糖通过乙酰化可转化为电离态糖[21]。

单糖的衍生化反应根据衍生化的顺序可分为柱前衍生化和柱后衍生化两种[31]。柱后衍生需要额外的设备作为衍生池,成本高,应用较少。柱前衍生化常用试剂有对氨基苯甲酸(paminobenzoic acid,p-AMBA)、邻氨基苯甲酸(o-aminobenzoic acid,OABA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)等。柱前衍生化后的单糖可使用普通烷基键合的硅胶柱C8和C18色谱柱便可实现对单糖的分离。

目前,最常用的单糖衍生剂为PMP。PMP是目前应用最广、适用性最高的单糖衍生剂[32],1989年[33]提出PMP衍生,PMP可使羰基上多两个吡喃啉酮单元,使单糖带有发色基团,它可以尽可能的减少色谱中杂峰的出现,PMP衍生化过程与单糖的结构性质有密切的关系,不同单糖由于其结构不同会产生不同的衍生产物[32];PMP衍生化后单糖在245 nm具有强烈的吸收峰,检出限低至μg/L,不需要对特定的单糖进行脱硫处理[34],该衍生物在4 ℃储存期长达60 d[35]。PMP衍生化的不足在于其单糖种类的分析结果可能会不完整[36],果糖和其他非还原糖分子上的空间位阻或缺乏醛基所致,不能与PMP等典型的衍生化试剂发生反应产生发色基团,致使无法对果糖进行检测,从而导致分析结果的不完整性[37]。

1.2.2 紫外检测器 相比未衍生化的单糖检测技术,衍生化后的HPLC-UV检测单糖的检测灵敏度更高,检出限更低,复现性更好。Bai等[38]利用HPLC-UV通过Agilent Eclipse XDB-C18column色谱柱分离检测客家米酒中的寡糖和单糖组成,其回收率为93.13%～102.08%,RSD为0.96%～2.48%,检出限为0.09～0.26 mg/L。UV检测器的响应值取决于单糖的摩尔吸收能力,即使在相似的结构单糖,其响应值大小也可能相差几个数量级[14]。戴军等[39]利用PMP-HPLC-UV经ZORBAX Eclipse XDB-C18柱对杜氏盐藻多糖的单糖组成进行分析,对8种中性糖、2种糖醛酸以及2种糖胺进行分离检测,其分离单糖数量较多,取样量少;但其单糖间的检出限以及定量限的差距较大;衍生化操作耗时(需100 min)。此外,低波长紫外检测器对淋洗液和样品基体非常敏感,这也限制了梯度洗脱方法的使用[40]。

1.2.3 荧光检测器 p-AMBA是FLD常用的衍生试剂,梁军等[41]建立了p-AMBA-HPLC-FLD单糖检测方法,其中8种单糖半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖的检出限小于0.2 mg/L,线性关系良好。

衍生化后的单糖检测技术往往提高了检测的灵敏度、降低了检出限和定量限,回收率较好,但是衍生化步骤繁琐、耗时,衍生过程不可避免会引入杂质,以及后续衍生剂的清除均可造成检测的误差。

2 气相色谱

气相色谱(gas chromatography,GC)利用试样中各组份在气相和固定相间的吸附或溶解能力不同,进行反复多次分配,从而达到不同单糖间的分离。气相色谱法具有灵敏度高、样品用量少等优点,适用于样品含量较低(10-8～10-9)的多糖的单糖组分分析[42]。GC常耦合的检测器有火焰电离检测器(flame ionization detector,FID)和MS。

2.1 衍生化

由于单糖具有非挥发性、热稳定性,因此气相色谱法检测前需要衍生化,常通过衍生化以提高糖类物质的挥发性以及挥发后的稳定性,最常用的衍生化方法是硅烷化和乙酰化[30]。硅烷化衍生法具有反应条件温和、操作简单、节省时间的优点,但容易产生副衍生物而造成多峰、重叠峰等现象,这给后续的定性工作带来较大困难,造成定量不准确。Haas等[30]针对从甲醛、乙醇醛、醛酮类三糖到己糖、多元醇和糖醛酸等单糖的GC衍生化反应进行了比较,得出乙酰化是单糖衍生化的优选。乙酰化衍生法能有效减少由于糖的异构化而造成的多峰现象,每种单糖都能获得单一的色谱峰,有利于对单糖进行准确地定性和定量分析[43]。

2.2 火焰电离检测器和质谱检测器

司雄元等[44]利用乙酰化-GC-FID对经DB-5色谱柱分离的三氟乙酸水解的微生物多糖和植物多糖中的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖6种单糖进行检测,其线性关系为2.00～100.00 mg/L,检出限均在0.11 mg/L以下。He等[45]利用乙酰化-GC-FID对四种海藻多糖进行单糖检测,分析出9种单糖,灵敏度、分离度较好,但果糖出现两个色谱峰。杨彬君等[46]对糖腈乙酸酯衍生化后的牛樟芝多糖中单糖经Agilent DB-WAX毛细管柱进行检测,检测出鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的峰面积的精确度RSD<1.76%,重现性的RSD<3.08%,该方法精确度和重现性良好。杨永晶等[43]利用乙酰化-GC-MS,建立了鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖的检测方法,并对树莓多糖进行检测,其线性范围为25～400 mg/L,各种单糖的平均回收率分别在96.4%～101.4%,该检测方法具有简便灵敏,精密度高,衍生物稳定,衍生杂质少,回收率稳定,重复性佳的优点,具有较强的适用性。

2.3 气相色谱法与高效液相色谱法的对比

有研究对比了GC和HPLC在单糖检测中各自的优缺点。例如:王潇瑞等[47]对比了乙酰化-GC-FID和PMP-HPLC分析石榴皮多糖的单糖组成方法,结果显示,GC法操作繁琐,试剂种类多、耗时长,不利于快速分析;PMP-HPLC相对操作简单,衍生化的试剂种类少,耗时短,工作效率高;毕欣宁等[48]对比了PMP-HPLC-DAD和GC-FLD测定黄芪多糖的单糖组成,结果表明,两种方法的专属性、精密度和稳定性都较好,重复性和加标回收率都较差,相对来说,PMP-HPLC的操作计算更为简便,在单糖组成分析上更具优势,但是由于复杂的衍生过程会降低中性单糖的加标回收率。

3 毛细管电泳

毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)主要通过电场作用下的电泳迁移和缓冲溶液作用力下的电渗迁移来实现单糖的分离。利用缓冲溶液的电渗流使单糖通过对其具有不同保留程度的第二相,达到分离的目的。

3.1 毛细管电泳的种类

毛细管电泳的分离模式可分为毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛细管等速电泳(capillary isotacho phoresis,CITP)、毛细管等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)和胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)等;耦合的检测器有UV、PAD、MS和激光诱导荧光检测器(laser Induced Fluorescence Detectors,LIFD)等。CE检测单糖常用两种模式:非衍生化的CE-UV检测和衍生化-CZE-UV。

3.2 质谱检测器和紫外检测器

Daniel等[49]利用CE-MS在12 min内完成了对咖啡中岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖9种单糖的检测,检出限低至0.18 mg/L。张欢欢等[50]利用CZE-UV以磷酸盐为分离缓冲体系,在10 min内完成了对巧克力、苹果醋、饮料冲剂等食品中4种糖类化合物(乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖)的快速检测,其灵敏度低,检出限分别为50、75、25和25 mg/L,定量限分别为150、225、75和75 mg/L,回收率在87.0%～107.0%之间。马海宁等[51]以对甲氧基苯胺为衍生试剂,采用CZE-UV分析了藏红花植物细胞多糖中的单糖组成,基线分离了11种结构相近的醛糖(来苏糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖)、酮糖(果糖)的衍生产物,该方法分离度好,适用于结构复杂的多糖中单糖组成的测定,各单糖的回收率在为94.3%～105.4%,检出限低至0.1 μmol/L。Rovio等[52]采用CZE-UV同时分离了柠檬、菠萝,橙子等水果中的木糖醇、甘露醇、蔗糖、岩藻糖、纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖12种糖类化合物,其检出限为5 mg/L。

相对于HPLC,HPCE利用极细的色谱柱作为分离柱,分离度高、效率高,是一种具有潜力的单糖检测技术,它仅需要微量的缓冲液、有机溶剂,具有经济性、高效性,以较HPLC快2～3个数量级的分离效率而应用于复杂多糖的分析,大大缩短了分析时间[8]。但是CE色谱柱的极低内径以及极低的样品注射量[53],导致CE具有较低的检测灵敏性,较低的重复性。

表3 常用糖类分析柱的类型及其特点

4 高效阴离子交换色谱

高效阴离子交换色谱(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)是一种强大的分析单糖组成工具,严格来讲,高效阴离子交换色谱法属于高效液相色谱法的一种。相对于HPLC,HPAEC更适合于极性强、无吸光基团的糖类化合物的检测。HPAEC利用单糖具有潜在的可电离羟基,在强碱性条件下呈现阴离子状态,根据电离的单糖所带电荷、疏水吸附性作用,分子量大小的不同实现单糖的分离。HPAEC常耦合脉冲安培检测器(pulsed ampere detection,PAD)为检测器,利用糖在电极表面的氧化还原反应来对单糖进行检测,结合固定相色谱柱的多选择性,无需衍生且具有极高的灵敏度;利用不同相对分子质量的低聚寡糖之间羟基解离度的稀薄差异实现他们的精细分离,使得几乎所有类别的醛糖醇、氨基糖、寡糖的混合物可以达到良好的分离效果。此外,其灵敏度低至μg/L,适合于单糖含量低的物质的检测,适用于糖类含量较少的样品的检测,为在常规检测器中响应很低的单糖分析提供了方法[54]。

4.1 常用色谱柱类型

HPAEC-PAD对糖类分离效果与色谱柱选择密切相关,不同类型糖的分离需选择相应色谱柱。例如:木糖与甘露糖以及阿拉伯糖和鼠李糖属于两对差向异构体,需要特定的糖柱结合适当流动相条件将其分离,CarborPac PA1为其分离提供了良好的条件。表3为HPAEC常用的分析柱的类型及其特点。

4.2 色谱条件对分离度的影响

HPAEC的分离条件对单糖的分离具有决定性的作用。HPAEC-PAD常以强碱性溶液(如:NaOH,KOH等)作为流动相,在同样的色谱柱的前提下,洗脱剂的浓度是影响糖类分离的首要原因,10～20 mmol/L NaOH对单糖进行洗脱分离常能达到很好的效果。Xie等[63]利用CarboPac PA10柱结合12.5 mmol/L NaOH作为流动相对青钱柳多糖中单糖进行检测,一次进样在20 min内快速分离了8种单糖(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖),其检出限在2.57～7.86 mg/L之间、重现性在98.53%～102.13%之间,加标回收率在94.34%～105.69%之间。

流动相的流速是决定HPAEC分离度的另一重要因素,较低的流速会提高分子扩散,色谱峰展宽,峰型变矮,保留时间和分析时间增长,但是高流速会使系统压力升高,分离度降低[69]。温度很小的变化(±5 ℃)可能引起单糖的保留时间的迁移以及单糖保留时间复现性的降低[70-71]。温度对分离度的影响因单糖种类不同而各异,例如:高温(40～50 ℃)是分解木糖和甘露糖的优选条件,而低温(20～25 ℃)条件下,阿拉伯糖和鼠李糖的分离效果更好[64]。温度的升高可以提高分离速度,但同时也会增大色谱峰宽[64]。HPAEC常用温度为20～30 ℃。

4.3 HPAEC-PAD的相关应用

潘丙珍等[59]利用HPAEC-PAD建立了烘焙咖啡豆及其掺假物中糖类标记物甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖的检测方法,7种糖在50 min内实现完全分离,分离度达到1.5以上,甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖在0.5～30 mg/L浓度范围内,木糖、甘露糖、果糖在1.0～30 mg/L浓度范围内具有良好的线性,相关系数在0.9990～0.9999之间;方法准确度和精密度良好,加标回收率在86.0%～101.0%之间,相对标准偏差(RSD)均小于5.0%。

刘芬等[72]利用HPAEC-PAD检测海参多糖中单糖组成,检测出9种单糖(岩藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖等),线性范围在0.25～50 mg/L,决定系数R2≥0.998,检出限为2.5～50 μg/L,加标回收率为83.65%～113.1%。杨洁等[73]采用CE对海参多糖中单糖组成进行检测,检测出9种单糖(氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖等),线性范围在0.5～10.0 mg/mL之间,决定系数R2≥0.982。同样针对海参多糖的单糖组成进行检测,相比之下,HPAEC可检测的浓度范围更大,且相关系数更高,检出限更低,灵敏度更高;CE检测的文献报道中未显示回收率的相关指标,可能是由于其回收率低。

Zhang等[54]对比了HPLC-ELSD、HPLC-RID和HPAEC-PAD三种方法对黄芪多糖中单糖含量的测定,发现ELSD和RID检测都不太理想,而HPAEC-PAD的回收率在97.83～102.05%之间,检出限达到μg/L,在阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和纤维二糖的检测定量中具有高精度、高准确度、高灵敏度。毕欣宁等[48]同样对黄芪多糖中的单糖组成进行检测,其中GC-FLD的精密度良好(RSD<0.06%),重复性好(RSD<7.21%),加样回收率为106.3%～131.0%;HPLC的精密度良好(RSD<3.27%),重复性好(RSD<10.85%),加样回收率为69.3%～204.1%。GC和HPLC需对单糖进行衍生化,操作繁琐;而HPAEC无需衍生前处理简便,在精密度,重复性、检出限和回收率等方法学验证指标下更具优势。

4.4 不足和改进

HPAEC在单糖检测方面也有其局限之处,主要表现以下四个方面:a. HPAEC检测常用NaOH溶液作为洗脱液,而NaOH容易与环境中CO2反应生成NaCO3,碳酸根属于强碱性二价阴离子,易与色谱柱中阴离子交换体结合,干扰碳水化合物的保留,导致保留时间缩短,柱选择性降低,分辨率降低。解决这一问题可从两个方向出发:一是尽可能的减少NaOH溶液受空气中CO2的影响,即充氮气保护;二是改变洗脱剂的耐受程度,即将易受碳酸盐影响的洗脱剂换为不易受碳酸盐干扰影响的KOH或向其中加入NaN3、钡和锶等可以沉淀碳酸盐的物质。Cataldi等[74]提出了钡离子和锶离子加入碱性洗脱液以降低二氧化碳的吸收。b. 早期使用三电位波形,单糖在金电极表面会发生氧化还原反应,造成单糖在电极表面的堆积产生不可逆污染,致使电极表面容易腐蚀[55],1998年提出使用四电位波形成功解决了这一问题,提高了检测器的重现性[75]。c. HPAEC需要样品不含有污染色谱柱的脂肪、阴离子洗涤剂以及强疏水性的有机化合物;不含会发生电化学干扰的强氧化还原性化合物[55]。d. HPAEC检测单糖时,一针样品运行完成后,色谱柱需要重新活化平衡后再对下一针样品进行检测,否则会出现下一针样品的出峰时间前飘的现象[76]。需要利用强洗脱阴离子(eg:NO3-、SO4-、AC-)进行柱后活化,由于NO3-、SO4-与固定相阴离子交换色谱柱具有强交换能力,会导致阴离子柱的容量下降,因此常使用NaAc作为柱活化剂,柱后使用NaAc作为活化剂可以提高单糖检测的灵敏性和复现性[77]。

5 结语

单糖分离技术快速发展,现阶段应用最广的单糖定量色谱技术为HPLC,高效液相色谱仪属实验室的基本仪器,适合于大范围推广,但其耦合的不同检测器都有其各自的优缺点。HPLC-RID无需衍生,操作简便,不可使用梯度洗脱,且受温度影响大,单糖的分离度达不到保障;HPLC-ELSD允许梯度洗脱,但存在检测灵敏度低的问题,相对分子质量小的糖类的线性关系不好;衍生化的HPLC-UV提升了检测方法的灵敏度,在灵敏度、复现性、线性关系中更具优势。但是衍生操作繁琐、浪费时间,且衍生可能会带入杂质,衍生试剂的清除以及衍生产物的稳定性为衍生化后续一系列问题。GC适合于复杂糖类化合物的检测,分离速度快,效率高,但是GC检测单糖需采用多种衍生试剂来完成单糖的衍生化过程,操作相当繁琐,且回收率低;其次,衍生产物常伴随着重现性低的特点,由于单糖具有差向异构体,在碱性条件下,会发生酮式和烯醇式的互换,从而造成多峰的出现,干扰单糖检测定量。MS在糖类结构解析方面具有独特优势,但是灵敏度和回收率均不佳。CE分辨率高,速度快,是一种具有潜力的单糖检测技术,仅需要微升级的缓冲液、有机溶剂以及添加剂,无需衍生分离效率高,适合于复杂样品的分离,但是由于CE使用极低内径的色谱柱检测糖类,进样量小,灵敏度低,不适用于含量少的样品检测。HPAEC-PAD属于HPLC的一种,适用于普通食品工业中的糖类检测的应用中,具有分析时间短、效率高、灵敏度高、检出限低、回收率高、样品前处理简单等优点,在未来单糖检测具有良好的应用前景,有望发展成为标准化的糖类检测技术。随着科学理论的不断发展,研究工作的不断深入,将会有更多、更有效的单糖组成检测方法逐步走向标准化。